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목차

Abstract 17

제1장 서론 22

제2장 본론 27

제1절 비만쥐(db/db mice)에서 함초열수추출물이 항당뇨와 산화적 손상에 미치는 영향 27

1. 서론 27

2. 실험 재료 및 방법 29

(1) 함초추출물의 조제 29

(2) 실험동물 및 식이 조성 30

(3) 혈당(blood glucose) 측정 32

(4) 당화혈색소 (glycated hemoglobin, HbA1c) 측정 32

(5) 포도당 부하 내성 검사(IPGTT; Intraperitoneal glucose tolerance test) 32

(6) 희생 및 채혈 방법 32

(7) 혈장에서의 insulin 함량 측정 32

(8) 혈중 지질과산화물 측정 33

(9) Western blotting 33

(10) 조직병리학적 검사 34

(11) 자료처리 방법 34

3. 결과 및 고찰 35

(1) 체중 증가량과 물 섭취량의 변화 35

(2) 혈당 변화 38

(3) 당화혈색소(HbA1c) 함량 40

(4) 포도당 부하 내성 검사(IPGTT; Intraperitoneal glucose tolerance test) 42

(5) 혈중 Insulin 함량 44

(6) 혈중 지질과산화물 함량 비교 46

(7) 간의 지질과산화물 함량 비교 48

(8) 지방조직에서 NF-kB의 발현량(발현양) 50

(9) 지방조직의 Histologic Photomicrogram 52

(10) 간조직에서 지방구(lipid droplet) 분포 56

(11) 신장조직의 Histologic Photomicrogram 60

4. 요약 66

제2절 염 민감쥐(Dahl salt-sensitive(salt-senstive) rat)에서 함초열수추출물의 혈압상승 억제 효과 및 산화적 스트레스 저하 효과 67

1. 서론 67

2. 실험 재료 및 방법 69

(1) 실험동물 및 식이조성 69

(2) 물 섭취량 및 식이효율 69

(3) 혈압 측정 69

(4) 희생 및 채혈 74

(5) 혈청에서 angiotensin I -converting enzyme (ACE) 활성 74

(6) 조직의 전처리 74

(7) Western blotting 75

(8) 혈장 및 뇨의 미네랄 함량 분석 75

(9) 혈중 지질과산화물 함량 측정 76

(10) 단백질 카르보닐화 화합물(PCOs) 함량 측정 76

(11) 혈장 및 뇨의 대사체 분석 76

(12) 자료처리 방법 77

3. 결과 및 고찰 78

(1) 체중 증가량과 식이 및 물 섭취량의 변화 78

(2) 수축기 및 이완기 혈압의 변화 82

(3) 혈청에서 angiotensin I -converting enzyme (ACE) 활성 86

(4) 혈압 조절 인자들의 발현량(발현양) 88

(5) 혈장에서의 미네랄 함량 92

(6) 뇨에서 미네랄 함량 95

(7) 혈중 지질과산화물 함량 97

(8) 간에서 단백질 산화 화합물 함량 99

(9) 지방조직에서 pIRS1ser307의 발현량(발현양)(이미지참조) 101

(10) 혈장 및 뇨의 대사체 분석 104

4. 요약 110

제3절 함초를 이용한 응용 제품의 생리활성 평가 111

1. 함초소금의 항당뇨 및 산화적 스트레스 저하 효과 111

(1) 서론 111

(2) 실험 재료 및 방법 113

1) 소금의 제조 113

2) 실험동물 및 식이 조성 113

3) 당화혈색소(HbA1c) 측정 113

4) 포도당 부하 내성 검사 (OGTT; Oral glucose tolerance test) 113

5) 희생 및 채혈 방법 114

6) 지방조직과 근육조직에서의 포도당 이용률 (glucose uptake) 측정 114

7) Western blotting 115

8) 혈중 지질과산화물 함량 측정 115

9) 뇨의 미네랄 함량 측정 116

10) 자료 처리 방법 116

(3) 결과 및 고찰 117

1) 체중 증가량과 식이 및 물 섭취량의 변화 117

2) 당화혈색소(HbA1c) 함량 119

3) 포도당 부하 내성 검사 (OGTT) 121

4) 지방조직과 근육조직에서의 포도당 이용률(glucose uptake) 123

5) 근육조직에서 pIRS1ser307의 발현량(발현양)(이미지참조) 125

6) 지방조직에서 NF-kB의 발현량(발현양) 127

7) 혈중 지질과산화물 함량 129

8) 뇨에서 미네랄 함량 131

(4) 요약 133

2. 함초 발효액의 이화학적 특성과 생리활성 조사 134

(1) 서론 134

(2) 실험 재료 및 방법 135

1) 실험재료 135

2) 일반성분 및 식염함량 분석 135

3) 무기질 분석 135

4) 유리아미노산의 분석 136

5) 총페놀성 화합물 함량 분석 136

6) 항산화 활성 137

7) Angiotensin I converting enzyme (ACE) 저해 활성 137

8) α-Glucosidase 저해 활성 138

9) 동물실험 138

10) 포도당 부하 내성 검사(Oral glucose tolerance test) 139

11) 통계 처리 139

(3) 결과 및 고찰 141

1) 일반성분 함량 141

2) 무기질 함량 143

3) 유리아미노산 함량 145

4) 총페놀성 화합물 함량 147

5) 함초발효액의 radical-scavenging 활성 149

6) 함초발효액의 ACE 저해 활성 151

7) 함초발효액의 α-glucosidase 저해 활성 153

8) 실험동물의 성장 상태 155

9) 포도당 부하 내성 검사(OGTT) 157

(4) 요약 159

3. 함초발효액으로부터 항산화물질 분리 160

(1) 서론 160

(2) 실험 재료 및 방법 160

1) 실험재료 160

2) 용매분획물의 조제 160

3) Sephadex LH-20 column chromatography의 분자크기에 의한 정제 161

4) Sephadex LH-20 column chromatography의 흡착에 의한 정제 161

5) 분리된 활성물질의 기기분석 161

6) 항산화 활성 측정 162

7) 정제 및 단리과정에서 항산화 활성 검정 163

(3) 결과 및 고찰 164

1) 함초발효액 용매분획물의 DPPH와 ABTS+ radical-scavenging 활성(이미지참조) 164

2) 활성물질의 단리 및 정제 167

3) 활성물질의 구조해석 168

4) 단리 화합물들의 DPPH 및 ABTS+ radical-scavenging 활성(이미지참조) 174

(4) 요약 178

참고문헌 179

국문초록 191

List of Tables

Table 1-1. Composition of AIN-93G and experimental diet 31

Table 1-2. Thickness of basal membranes in glomerulus of mice fed diets containing hot water extract of glasswort 65

Table 2-1. Mineral composition in the plasma of rats fed diets containing hot water extract of glasswort 94

Table 2-2. Mineral composition in the urine of rats diets containing hot water extract of glasswort 96

Table 2-3. Metabolites in plasma of rats fed diets containing hot water extract of glasswort. 107

Table 2-4. Metabolites in urine of rats fed diets containing hot water extract of glasswort. 109

Table 3-1-1. General characteristics of rats fed diets containing 8% salt 118

Table 3-1-2. Urine mineral contents and mineral excretion of rats fed diets containing 8% salt 132

Table 3-2-1. Composition of control and experimental diets 140

Table 3-2-2. Proximate compositions of glasswort juices fermented for different periods 142

Table 3-2-3. Mineral contents of glasswort juices fermented for the different periods 144

Table 3-2-4. Free amino acid contents of glasswort juices fermented for the different periods 146

Table 3-2-5. Effects of supplementation of fermented glasswort juice on the body weight, food intake, water intake, and FER in SD rats. 156

Table 3-3-1. ¹H- (400 MHz) and 13C- (100 MHz) NMR data of 1 (CD₃OD)(이미지참조) 171

Table 3-3-2. ¹H- (400 MHz) and 13C- (100 MHz) NMR data of 2 (DMSO-d6)(이미지참조) 172

Table 3-3-3. Free radical-scavenging activities of the compounds isolated from fermented glasswort juice. 177

List of Figures

Fig. 1. Insulin signaling pathway. 26

Fig. 1-1. Produce of hot water extract powder of glasswort. 29

Fig. 1-2. Change of body weight in mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 36

Fig. 1-3. Change of water intake in mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 37

Fig. 1-4. Change of blood glucose content of mice fed dites containing hot water extract of glasswort. 39

Fig. 1-5. Change of glycated hemoglobin (HbA1c) of mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 41

Fig. 1-6. Intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) of mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 43

Fig. 1-7. Plasma insulin content of mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 45

Fig. 1-8. Plasma lipid peroxide contents of mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 47

Fig. 1-9. Lipid peroxide contents in liver tissue of mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 49

Fig. 1-10. Expression level of NF-kB in adipose tissue of mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 51

Fig. 1-11. Light microscopic images (x200) of adipose tissues in mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 54

Fig. 1-12. Transmission electron microscopic (TEM) images of adipose tissues in mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 55

Fig. 1-13. Light microscopic images of normal and fatty livers. 57

Fig. 1-14. Light microscopic images (x200) of lipid droplets or vacuoles in livers of mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 58

Fig. 1-15. Transmission electron microscopic (TEM) images of lipid droplets in livers of mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 59

Fig. 1-16. Diagram that shows scientific term of glomerulus in kidney 61

Fig. 1-17. Light microscopic images of kidney tissue of mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 62

Fig. 1-18. Diagram shows detailed structure of glomerulus. 63

Fig. 1-19. TEM images of glomerulus in kidneys of mice fed normal (N) and solar salt diet (C). 63

Fig. 1-20. TEM images of glomerulus in kidneys of mice fed diets containing hot water extract of glasswort. 64

Fig. 2-1. PhysioTelR PA-C40 small animal transmitter.(이미지참조) 71

Fig. 2-2. Surgical implantation of PhysioTelR PA-C40 transmitter.(이미지참조) 72

Fig. 2-3. PhysioTelR PA-C40 telemetry systems for blood pressure measurement by Dataquest A.R.T. 4.3 software.(이미지참조) 73

Fig. 2-4. Body weight in rats fed diets containing hot water extract of glasswort. 79

Fig. 2-5. Food intake in rats fed diets containing hot water extract of glasswort. 80

Fig. 2-6. Water intake in rats fed diets containing hot water extract of glasswort. 81

Fig. 2-7. Changes of systolic blood pressure in rats fed diets containing hot water extract of glasswort. 83

Fig. 2-8. Changes of diastolic blood pressure in rats fed diets containing hot water extract of glasswort. 85

Fig. 2-9. Levels of ACE activity in serum of rats fed diets containing hot water extract of glasswort. 87

Fig. 2-10. VEGF and RhoA related-high blood pressure signaling pathway. 89

Fig. 2-11. Protein expressions level of VEGF in kidney by western blotting analysis. 90

Fig. 2-12. Protein expressions level of RhoA in kidney by western blotting analysis. 91

Fig. 2-13. Lipid peroxidation in plasma of rats fed diets containing hot water extract of glasswort. 98

Fig. 2-14. PCOs contents in liver of rats fed diets containing hot water extract of glasswort. 100

Fig. 2-15. Schematic shows mechanisms of TNF/FFA-mediated inhibition of insulin signaling pathway. 102

Fig. 2-16. Protein expressions level of pIRS1ser307 in adipose tissue by western blotting analysis.(이미지참조) 103

Fig. 2-17. PLS-DA score plot (A), PLS-DA loading plot (B) and S-plot (C) of UPLC-Q-TOF MS data set of metabolites in plasma of rats fed glasswort(galsswort) extract for four weeks. 106

Fig. 2-18. PLS-DA score plot (A), PLS-DA loading plot (B) and S-plot (C) of UPLC-Q-TOF MS data set of metabolites in urine of rats fed glasswort(galsswort) extract for four weeks. 108

Fig. 3-1-1. Change of blood glycated hemoglobin (HbA1c) of rats fed diets containing 8% salt. 120

Fig. 3-1-2. Change of blood glucose levels during oral glucose tolerance test (OGTT) of rats fed diets containing 8% salt. 122

Fig. 3-1-3. Glucose uptake into adipose tissue (A) and skeletal muscle (B) in rats fed diets containing 8% salt. 124

Fig. 3-1-4. Protein expressions level of pIRS1ser307 in skeletal muscle of rat fed diets containing 8% salt.(이미지참조) 126

Fig. 3-1-5. Protein expressions level of NF-κB in adipose tissue of rat fed diets containing 8% salt. 128

Fig. 3-1-6. Lipid peroxidation in plasma of rats fed diets containing 8% salt. 130

Fig. 3-2-1. Total phenolic contents of glasswort juices fermented for the different periods. 148

Fig. 3-2-2. DPPH (A), and ABTS+ (B) radical-scavenging activities of glasswort juices fermented for the different periods.(이미지참조) 150

Fig. 3-2-3. ACE inhibition activities of glasswort juices fermented for the different periods. 152

Fig. 3-2-4. α-Glucosidase inhibition activities of glasswort juices fermented for the different periods. Values are mean±SD of triplicate experiments.... 154

Fig. 3-2-5. Oral glucose tolerance test of SD rats fed diets containing fermented glasswort juice for four weeks. Values are mean±SD (n＝9). ns: satatistically no significant difference at p〈0.05 by t-test.... 158

Fig. 3-3-1. DPPH radical-scavenging activity of each fraction after solvent fractionation of fermented glasswort juice. 165

Fig. 3-3-2. ABTS+ radical-scavenging activity of each fraction after solvent fractionation of fermented glasswort juice.(이미지참조) 166

Fig. 3-3-3. Structures of 1 and 2. 173

초록보기

함초는 다른 육상식물들과 달리 고염과 함께 다수의 미네랄 성분들을 다량 함유하고 있으며 dicaffeoylquinic acid류 등의 chlorogenic acid계 화합물과 isorhamnetin, quercetin 등의 기능성 성분을 함유하고 있다. 또한 이 식물은 항산화, 항당뇨, 항암, 항비만, 면역활성 촉진효과, 항균작용, 항고지혈증, 및 노화억제작용 등등의 다양한 생리활성을 갖고 있다. 이처럼 생리활성이 우수한 함초를 다양한 식품소재로 활용하기 위해 자연 건조한 함초를 130℃에서 5시간 동안 고압 열수 추출한 후, 분무 건조하여 제조한 함초추출물과 함초 응용제품을 이용하여 다양한 질환 모델의 실험동물을 대상으로 항당뇨 효과와 혈압 상승 억제에 미치는 영향을 조사하였다.

Leptin receptor의 결함으로 인한 과식과 과음으로 자발적 비만과 인슐린 저항 식이성이 유발되는 db/db mice에서 함초열수추출물의 식이는 당화혈색소(HbAlc)의 함량을 낮추고, hyperinsulinemia를 지연시키는 효과를 나타냈으며 산화적 스트레스로부터 혈액과 간조직의 지질과산화물(MDA)의 발생을 억제시키는 효과가 나타났다. 또한 지방조직, 간 및 신장조직에 대한 조직학적 변화를 관찰한 결과, 함초열수추출물 섭취군은 지방세포의 괴사(crown-like structure)와 간조직의 lipid droplet 형성이 현저하게 억제됨을 확인하였으며, 신장조직 기저막의 형태는 정상군과 유사하였다.

함초열수추출물과 함초-식물 열수추출물은 소금 섭취 시, 자발적으로 혈압이 상승하는 염 민감쥐인 Dahl salt-sensitive rat에서 식이기간 동안 소금 섭취로부터 오는 혈압 상승을 억제하는 효과를 보였다. 특히 함초와 건강기능성이 우수한 식물자원을 혼합하여 제조한 GG는, 식이기간 동안 소금섭취로 인한 염 민감쥐의 혈압 상승을 유발하지 않고 식이 전과 거의 유사한 수축기와 이완기 혈압을 나타냈으며, 천일염(SS) 식이군에 비해 높은 ACE 저해 활성을 보였다. 또한 혈압을 낮추는데 관여하는 VEGF의 발현양을 증가시키고, myosin phosphatase를 저해하여 혈관긴장도(vascular tone)를 높여 혈압을 상승시키는데 관여하는 RhoA 발현양을 낮추어 혈압 상승을 억제하는 것으로 나타났다. 함초추출물 식이군들의 산화적 스트레스 억제 효과에서도 혈중 지질과산화물, 간에서의 단백질 산화물의 함량 및 지방세포에서의 pIRS1ser307의 발현양이 낮게 나타나, 과다 소금섭취로부터 오는 산화적 스트레스를 줄여 주었다. 혈장과 뇨의 대사체를 분석한 결과, 함초추출물 식이군은 천일염 식이군과 다른 대사체 양상을 보여, 함초추출물이 체내에서 대사체에 미치는 영향이 다른 것으로 추측되었다.

함초를 이용한 응용제품으로 미네랄이 풍부한 천일염과 함초를 혼합하여 함초소금을 제조하고, 제조된 소금이 항산화 및 항당뇨에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Spraque-Dawley 쥐에 각각 8%의 천일염, 함초소금, 바질소금이 함유된 사료를 4주간 급여하였다. 각 식이군의 포도당 내성에 대한 검사 결과, 함초소금 식이군이 당 내성을 개선하는 효과를 보였고, 지방 및 근육 조직에서 당 이용률 또한 천일염 식이군에 비하여 높게 조사되었다. 인슐린 신호전달 경로에서 인슐린 저항성을 유도하는 pIRS1ser307와 NF-κB의 발현양을 조사한 결과, 함초소금 식이군에서 가장 낮은 발현양을 나타냈다. 소변에서 Na/K비는 천일염 식이군이 가장 높았고, 함초소금 식이군이 유의적으로 낮게 조사되어, 함초소금이 혈압에도 긍정적인 영향을 미치고 있음을 알 수 있었다.

또 다른 함초 응용제품으로, 함초와 당을 혼합하여 2년 혹은 6년간 발효시킨 다음 여과하여 얻어진 여액을 상온에서 자연 발효시켜 제조한 자연발효 함초액의 이화학적 특성 및 생리활성을 조사하였다. 함초발효액의 당 함량은 45%내외로 이는 당 침출에 의한 제조 방법 때문이며, Na을 제외한 주요 무기질은 K, Mg, 그리고 Ca으로, 그 중 K함량이 가장 높게 나타났다. 주요 유리아미노산은 alanine, proline, aspartic acid, 그리고 lysine으로, 이들 일반 성분들의 발효기간에 따른 차이는 거의 없었다. 총페놀성 화합물 함량은 약 50 CAE mg/100 mL이고, DPPH와 ABTS+ radical-scavenging활성은 ascorbic acid와 거의 유사할 정도의 활성을 보였다. 또한 함초발효액은 ACE 및 α-glucosidase에 대해서도 저해 활성을 보였으며, 특히 α-glucosidase 저해활성은 장기 발효된 함초발효액(LFGJ)에서 좀 더 높은 활성을 나타냈다. 이에, 장기 발효된 함초발효액(LFGJ)을 4%의 고염식이군 실험쥐(SD rat)에 급여한 결과, 일반적인 특성은 대조군(4% 고염식이군)과 차이가 없었으나, 함초발효액군(FGJ; 4% 고염식이+2% LFGJ)의 체중증가량이 통계적 유의성은 없었으나 더 낮은 경향을 보였고, 포도당 내성 실험 결과, 함초발효액군(FGJ)에서 포도당 내성이 더 개선되는 것으로 조사되었다.

이중, 함초발효액의 항산화 활성에 대한 기능성 해명과 유용 성분 탐색을 위해 함초발효액으로부터 항산화 활성물질을 분리하여 구조해석하였다. 함초발효액을 용매분획하여 얻어진 용매분획물 중 CHCl₃층이 비교적 높은 항산화 활성을 나타냈다. 이를 Spedex LH-20 column chromatography의 분자 크기와 흡착에 의해 정제하여 항산화 활성물질 2종을 분리하였다. 분리된 이들 화합물을 대상으로 MS 및 NMR 분석을 실시한 결과, 5-hydroxymethyl-2-furancarboxylic acid (1)과 chrysoeriol (2)로 동정되었다. 이 화합물들은 ABTS+ 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈으며 화합물 2는 화합물 1에 비해 약간 높은 활성을 나타냈다.

이와 같이, 함초는 비만 혹은 고염식이와 같은 산화적 스트레스로부터 오는 혈압 상승과 인슐린 저항성을 개선하여 당뇨 병변 현상의 지연 및 완화에 매우 우수한 효과가 있을 것으로 생각되며, 향후 기능성 소재로써의 가치가 충분한 식품 소재로 생각된다.

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