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Title Page

Contents

ABSTRACT 10

I. Introduction 12

II. Material and Methods 15

2.1. Experimental design 15

2.2. Isolation of lactic acid bacteria (LAB) from kefir and kimchi 17

2.3. Separation of cell-free supernatants according to the growth conditions of LAB strains 17

2.4. Determination of the antimicrobial activity of LAB supernatants against canine periodontal pathogens 17

2.5. Sensitivity of LAB metabolites to heat, pH, and enzymes 18

2.6. Analysis of organic acids 19

2.7. Exopolysaccharide (EPS) purification from LAB 19

2.7.1. Preparation of EPSs 19

2.7.2. Antimicrobial activity of EPSs 20

2.7.3. Quantification of EPS yield 20

2.7.4. Determination of monosaccharides composition of EPSs from LAB 20

2.8. Polypeptide (PP) purification produced by LAB 21

2.8.1. Preparation of PPs 21

2.8.2. Antimicrobial activity of PPs from LAB 21

2.8.3. Quantification of PP yield 21

2.8.4. Molecular weight of the PPs 22

2.9. Statistical analysis 22

III. Results and Discussion 23

3.1. Antimicrobial activity of cell-free supernatant of LABs against canine periodontal pathogens 23

3.2. Stability characterization of metabolites produced by LAB 30

3.2.1. Sensitivity to heat treatment 30

3.2.2. Tolerance to pH extremes 36

3.2.3. The effect of enzymes 42

3.3. Quantification of organic acids 45

3.4. Yield of EPSs and PPs isolated from LAB 50

3.5. Comparison of antimicrobial activities of EPSs from LAB 54

3.6. Monosaccharide composition of EPSs from LAB 57

3.7. Comparison of antimicrobial activity of PPs from LAB 59

3.8. Determination of the molecular weight of PPs from LAB 62

3.9. General Discussion 62

IV. Conclusion 64

References 65

Abstract (in Korean) 79

List of Tables

Table 1. Classification according to the presence and size of the clear zone in the spot-on-lawn assay of Porphyromonas cangingivalis and Porphyromonas gulae. 27

Table 2. Antimicrobial activity of cell-free supernatants of kefir-derived LAB against Porphyromonas cangingivalis and Porphyromonas gulae. 28

Table 3. Antimicrobial activity of cell-free supernatants of kimchi-derived LAB against Porphyromonas cangingivalis and Porphyromonas gulae. 29

Table 4. Antimicrobial activity of supernatants of kefir-derived LAB after heat treatment against Porphyromonas cangingivalis and Porphyromonas gulae. 33

Table 5. Antimicrobial activity of supernatants of kimchi-derived LAB against Porphyromonas cangingivalis and Porphyromonas gulae. 35

Table 6. Antimicrobial activity of supernatants of kefir-derived LAB after pH adjustment (pH 2–9) against Porphyromonas cangingivalis and Porphyromonas gulae. 39

Table 7. Antimicrobial activity of supernatants of kimchi-derived LAB after pH adjustment (pH 2-9) against Porphyromonas cangingivalis and Porphyromonas gulae. 41

Table 8. Antimicrobial efficacy of supernatants of LAB after enzyme treatment against Campylobacter rectus, Porphyromonas cangingivalis, and Porphyromonas gulae. 43

Table 9. Organic acid contents in MRS broth and cell-free supernatants of LAB. 48

Table 10. Antimicrobial efficacy of lactic acid (300 mM) and propionic acid (25 mM) against Campylobacter rectus, Porphyromonas cangingivalis, and Porphyromonas gulae. 49

Table 11. Purified exopolysaccharide (EPS) yield from LAB culture (in 1 L of MRS broth) and EPS concentrations for antimicrobial test. 52

Table 12. Purified polypeptide (PP) yield from LAB culture (in 1 L of MRS broth) and PP concentration for antimicrobial test. 53

Table 13. Antimicrobial activity of purified exopolysaccharide from LAB against Porphyromonas cangingivalis and Porphyromonas gulae. 56

Table 14. Antimicrobial activity of purified polypeptide from LAB against Porphyromonas cangingivalis and Porphyromonas gulae. 61

List of Figures

Figure 1. Schematic diagram of experimental design and procedures. 16

Figure 2. Growth curve of Campylobacter rectus in a nutrient broth mixed with cell-free supernatant of (A) Lactobacillus kefiranofaciens DD2, (B) L. kefiranofaciens DN1, (C) Lentilactobacillus kefiri DH5, and (D) Leuconostoc mesenteroides DH1608... 24

Figure 3. Growth curve of Campylobacter rectus in a nutrient broth mixed with cell-free supernatant of (A) Lactiplantibacillus plantarum DY6, (B) DY7, (C) DY8, (D) DY12, and (E) DY26 incubated under different conditions (24 h, 30 ℃; 24 h, 37 ℃). 25

Figure 4. Antimicrobial efficacy of supernatants of kefir-derived LAB after heat treatment against Campylobacter rectus. 32

Figure 5. Antimicrobial efficacy of supernatants of kimchi-derived LAB after heat treatment against Campylobacter rectus. 34

Figure 6. pH of cell-free supernatants of LAB. 37

Figure 7. Antimicrobial efficacy of supernatants of kefir-derived LAB after pH adjustment (pH 2–9) against Campylobacter rectus. 38

Figure 8. Antimicrobial efficacy of supernatants of kimchi-derived LAB after pH adjustment (pH 2–9) against Campylobacter rectus. 40

Figure 9. Chromatogram from HPLC analysis of organic acids. 47

Figure 10. Antimicrobial efficacy of purified exopolysaccharide against Campylobacter rectus. 55

Figure 11. Chromatogram from HPLC analysis of monosaccharide standards. 58

Figure 12. Antimicrobial efficacy of purified polypeptide against Campylobacter rectus. 60

초록보기

유기산, 다당류, 박테리오신과 같은 유산균의 항균성 대사산물은 병원균을 억제함으로써 만성 질환 및 면역 조절에 중요한 역할을 한다. 반려견의 치주질환은 치주 병원균에 의해 발생하는 가장 흔한 만성 염증성 질환이다. 반려견의 치주염은 항생제 내성 문제로 인해 천연 항균제를 사용하여 효과적으로 제어되어야 한다. 그러나 식품에서 분리된 유산균을 이용하여 반려견의 치주질환 병원균을 억제하는 연구는 거의 보고되지 않았다. 따라서 본 연구는 Campylobacter rectus, Porphyromonas cangingivalis 및 Porphyromonas gulae의 세 가지 구강 병원균에 대한 LAB 배양물 및 대사산물의 항균 활성을 조사하는 것을 목적으로 한다.

케피어와 김치에서 다양한 유산균을 분리하고 growth curve analysis와 spot-on-lawn assay 방법으로 항균 활성을 측정하였다. 케피어에서 분리한 유산균들은 치주 병원균에 대해 정균과 성장 억제 효과를 나타냈다. Lp. plantarum은 C. rectus의 성장을 완전히 억제했고, P. cangingivalis와 P. gulae에 대해 7.5 mm 이상의 저해환을 생성했다. L. kefiranofaciens DN1, Leu. mesenteroides DH1608, Lp. plantarum strains의 배양액은 100 °C와 121 °C 열처리 후에도 높은 항균 활성 (＞ 90%)을 나타냈다. pH 2-4의 산성 조건에서 모든 유산균 배양액의 항균 활성은 80% 이상으로 유지했다. 이후 유산균의 잠재적 항균 대사산물을 조사하였다.

유산균 대사산물 중 유기산, 다당류, 펩타이드의 특성과 항균 효능을 조사했다. 모든 유산균은 24.97 ± 2.75 mg/mL의 유산을 생성하였다. 김치 분리체보다 케피어 분리체에서 EPS와 PP가 더욱 생성되었다 (0.68 vs 0.48 mg/mL 및 10.30 vs 8.49 mg/L). L. kefiranofaciens DN1을 제외한 모든 유산균에서 생산된 다당류는 C. rectus를 유의하게 억제하였고 (p ＜ 0.05), Lp. plantarum DY8에서 생성된 다당류의 억제 활성이 가장 높았다. 유산균에서 생산된 다당류는 공통적으로 glucose와 galactose를 포함하였다. L. kefiranofaciens DD2에 의해 생산된 펩타이드만이 C. rectus와 P. gulae에 대해 항균 활성을 나타냈고, 펩타이드 수율은 다른 유산균보다 유의하게 높았다 (12.58 ± 0.77 mg/L, p ＜ 0.05). L. kefiranofaciens DD2의 펩타이드는 분자량이 28 kDa인 class Ⅲ 박테리오신인 것으로 확인되었다.

케피어와 김치 유산균들 중에 L. kefiranofaciens DD2에 의해 생성된 유산, 다당류, 박테리오신을 포함한 항균 대사산물은 상당한 항균력을 보이며 생산량이 많아 치주 병원균에 대한 구강 포스트바이오틱스 후보임을 입증했다. 유산균 대사산물은 반려견 치주 질환 치료 혹은 예방 측면에서 항생제를 대체할 수 있는 천연 항균제로서의 잠재력을 가지고 있음을 나타낸다.

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