암은 세계적으로 가장 중요한 공중보건 문제 중 하나로, 환자 사망률에 큰 영향을 미친다. 인간과 반려 동물 모두에서 암의 발생률은 점점 증가해왔으며, 생존율 증가를 위해 암의 조기 발견 및 정확한 진단이 환자 예후 개선에 매우 중요하다. 따라서, 지난 몇 십년 동안 암의 조기 발견과 예후 평가에 기여할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위한 다양한 연구들이 진행되었다. 최근 몇 년 동안, 유전체학, 단백체학, 대사체학 등의 기술 발전에 힘입어 암 바이오마커 분야에서 상당한 진전이 이루어졌다. 이러한 발전은 진단 정확도와 예측력이 향상된 새로운 바이오마커의 발견을 용이하게 했으나 이러한 발전에도 불구하고, 여전히 높은 정확도를 가진 새로운 바이오마커의 발견이 필요하다. 본 논문에서는 분비 단백질인 NAG-1과 TSP-1이 종양 발생 과정에서 어떠한 역할을 하는지 살피고 암의 바이오 마커 및 치료 타겟으로써의 활용 가능성을 연구했다.

Chapter I , 갑상선암 환자의 종양과 인접한 정상 조직을 사용하여 항체 어레이 실험을 진행했고 이를 통해 몇 가지 후보 단백질을 선정했다. Mature-form의 nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)-activated gene-1 (NAG-1)은 정상 조직보다 종양조직에서 더 많이 발현했다. 그러나 단백질 면역 블롯으로 다시 확인하였을 때, 정상 조직에서 pro-form의 NAG-1의 발현이 증가했다. 또한 항암효과를 가지고 있는 phytochemicals 및 NSAIDs를 갑상선 암세포에 처리했을 때, pro-NAG-1의 발현이 증가했다. 그 중 퀘르세틴 (quercetin)이 가장 강하게 pro-NAG-1을 증가시킴으로써, 세포사멸 (apoptosis)을 일으키고 세포 주기를 멈췄다. 퀘르세틴은 p53, C/EBP α, C/EBP δ 를 통해 NAG-1의 프로모터를 활성화시켜 pro-NAG-1을 유도하였고 이를 통해 항암활성을 보였다.

ChapterII, 갑상선 정상 조직보다 종양 조직에서 더 많이 발현되었던 트롬보스폰딘 1 (thrombospondin1, TSP-1)은 여러 생물학적 기능을 하는 당단백질로 발현되는 기관에 따라 혹은 결합하는 수용체에 따라 그 역할이 달라진다. 특히 암 종류에 따라 암을 억제하거나 혹은 악화시키는 반대되는 역할을 하는 경우가 있는데 아직 그 기전이 정확히 밝혀지지 않았다. 항체 어레이의 결과를 확정하기 위해 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)과 단백질 면역 블롯을 진행하였으며, 이 과정에서 intron retention (IR)을 통해 생성되는 transcriptional variant (TSP1V)를 발견했다. TSP-1 wild-type (TSP1W)은 종양 조직에서, TSP1V는 정상 조직에서 더 많이 발현되었다. TSP1W는 갑상선 암에서 암을 악화시키는 기능을 하기 때문에 TSP1V가 반대되는 역할을 할 것으로 가설을 세우고 다음 연구를 진행했다. TSP1V 유전자를 클로닝하여 갑상선 암세포주에 과발현시키고 단백질의 생성 여부를 확인하였을 때, TSP1W와 TSP1V는 배지의 혈청 농도에 따라 바로 배지로 분비되기도, 혹은 세포 외 기질 (ECM)에 저장되기도 했다. 또한, TSP1V를 과발현시킨 갑상선암 세포주를 사용하여 단백질의 기능 연구를 진행한 결과 in vitro 실험에서 TSP1V는 갑상선 암의 증식, 이동, 침습, 콜로니 형성 및 스페로이드 형성을 억제했다. 더불어 in vivo 실험에서 TSP1V는 마우스 피하에 이식한 갑상선 암세포로 발생한 종양의 증식을 억제했다. TSP1V의 항암 메커니즘을 확인하기 위해서 TPS1W의 가장 잘 알려진 signaling pathway 중 하나를 이용했다. Empty vector, TSP1W, TSP1V를 transfection하여 만든 stable cell line에 TGF-β를 시간별로 처리한 후 단백질을 추출하여 단백질 면역 블롯을 시행했다. 그 결과 TSP1V stable cell line에서는 smad2와 FAK 모두 TGF-β 처리에 의한 인산화가 일어나지 않았다. 항암효과를 가지고 있는 TSP1V를 증가시키기 위해 phytochemicals와 NSAIDs를 처리했고, 여러 항암 물질 중 trans-chalcone이 TSP1V를 가장 많이 증가시키면서 동시에 TSP1W를 가장 많이 감소시켰다. 이를 증명하기 위해 mini-gene system을 디자인했으며 high contents screening system인 CX7 LZR을 이용해 실험을 진행했다. trans-chalcone은 IR 발생을 증가시켜 TSP1V의 발현을 증가시키고 GFP를 감소시켰다. trans-chalcone 및 sulindac sulfide에 의한 IR의 메커니즘을 밝히기 위해 여러 splicing factor를 살폈고 그 중 RNA binding motif protein 5 (RBM5)의 과발현은 항암 물질 처리에 의한 IR을 억제했다. 반대로 RBM5의 유전자 기능 감소를 위한 siRNA를 사용했을 때 IR은 항암 물질 처리에 의해 증가했다. 또한, sulindac sulfide는 RBM5의 활성화 형태인 인산화를 억제함으로써 IR을 증가시켰다. 한편, combined bisulfite restriction analysis (COBRA)를 통해 trans-chalcone은 DNA를 디메틸화 시킴으로써 IR을 증가시키는 것을 확인했다. 또한 trans-chalcone은 TSP1W, DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3 beta (DNMT3b), methyl CpG binding protein 2 (MeCP2)를 처리한 시간에 따라 감소시켰다. 마지막으로 갑상선 결절 및 갑성선 분화암의 종양 조직과 인접한 정상 조직을 사용하여 RT-PCR과 quantitative RT-PCR (RT-qPCR)을 시행했다. 그 결과, TSP1V와 TSP1W의 비율이 양성 및 악성 종양 사이에서 유의한 차이를 보였다.

ChapterIII, TSP-1이 다른 종류의 암에서도 유사한 특성을 보이는지 연구를 진행했다. 특히 개의 유선종양과 같은 경우, 사람의 유방암과 유사한 임상적 특성을 나타내기 때문에 사람의 유방암에서의 TSP-1에 대한 이해가 개의 유선종양에도 적용될 수 있을 것으로 기대되어 사람과 개에서 모두 연구를 진행했다. 이 과정에서 TSP1V가 사람과 개 모두에서 발현된다는 것을 발견했다. 또한, 유방암 및 골육종 세포에 대해 담나칸달 (damnacanthal)과 제니스테인 (genistein)과 같은 phytochemicals을 처리했을 때, TSP1V의 발현이 증가하고 TSP1W의 발현이 감소하면서 세포의 증식이 억제되었다. 더불어 유선종양을 가진 개에서 채취한 정상 및 종양 조직을 사용하여 RT-PCR을 실시한 결과, 정상 조직은 더 높은 수준의 TSP1V를 나타내었으며 종양 조직은 더 높은 수준의 TSP1W를 나타내었다.

결과적으로 이 연구는 NAG-1과 TSP-1과 같은 분비 단백질들이 갑상선암, 유방암과 같은 암의 진단용 마커로 사용될 수 있을 뿐 아니라 치료 타겟으로도 가능성이 있음을 시사하였으며, 또한 다루어진 단백질들의 항암 효과에 대한 분자 생물학적 기작을 일부 제공하였다.