[표제지 등]
제출문
요약문
Summary
목차
제1장 서론 17
제2장 과제구성 20
제3장 세부과제별 내용 22
대량생산 및 임상용 초순도제품 정제공정 개발 23
요약문 24
SUMMARY 26
목차 28
제1장 서론 30
제2장 연구추진방법 31
제1절 발효공정 31
제2절 정제공정 31
제3장/3. 연구수행 결과 32
제1절 연구내용 32
제2절 연구결과 33
제3절 연구성과 34
제4장 결론 41
HT003계열 M3S 항암제의 약효연구 42
요약문 43
SUMMARY 45
목차 48
제1장 서론 50
제2장 연구추진방법 53
제1절 시험물질 53
제2절 시험대상 및 유지 53
제3절 시험방법 53
제3장 연구결과 55
제1절 M3S와 Cisplatinum의 항암효과의 비교 55
제2절 SK-HEP 선암에 대한 M3S의 항암효과 55
제4장 결론 56
제5장 참고문헌 57
뇌종양에서 M3S TNF-α의 암 성장억제효과에 관한 실험적 연구 61
요약문 62
SUMMARY 64
목차 66
제1장 서론 68
제2장 국내외 기술개발 현황 70
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 71
제1절 뇌암 등 암세포주에 대한 M3S TNF-α의 세포살상능 검증 71
제2절 뇌암 동물 모델의 개발 및 응용 73
제3절 동위원소표지를 이용한 M3S TNF-α의 뇌암내 흡수 동태파악 76
제4절 9L Gliosarcoma 세포주 뇌암 동물모델을 이용한 M3S TNF-α의 뇌암 치료효과 판정 77
제5절 C6 Glioblastoma 세포주 뇌암 동물모델을 이용한 M3S TNF-α의 뇌암 치료효과 판정 79
제6절 도관삽관 동물 뇌암 모델을 이용한 종양내 투여법에 의한 M3S TNF-α 효과 판정 80
제7절 항암제 및 유전자치료와의 복합치료법 개발을 위한 실험연구[원문불량;p.81~82] 82
제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 87
제5장 연구개발 결과의 활용 계획 88
제6장 참고문헌 89
택솔 및 방사선과의 병용치료연구 91
요약문 92
목차 94
제1장 서론 96
제2장 연구추진방법 97
제3장 연구결과 98
제4장 결론 101
HT003계열 종양괴사인자 항암제의 Beagle Dog에서의 4주 아급성독성 연구 104
요약문 105
목차 106
제1장 서론 107
제2장 연구추진방법 108
제1절 시험물질 108
제2절 실험방법 108
제3장 연구결과 및 고찰 109
제4장 결론 111
Appendix 112
M3S의 초순수 분리와 분자 3차구조 규명 138
요약문 139
Summary 141
목차 143
제1장 서론 145
제2장 국내외 기술개발 현황 145
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 146
제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 147
제5장 연구개발결과의 활용계획 148
종양괴사인자의 구조와 기능간의 상관성 연구 151
요약문 152
Summary 154
목차 156
제1장 서론 163
제2장 국내외 개발 현황 168
제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 170
제1절 연구내용 170
3.1.1. 단백질의 변성된 상태 170
3.1.2. Protein folding의 모델들 172
3.1.3. W114F 돌연변이체 176
3.1.4. 소수성 Tryptophan 잔기들의 용매접근도 연구 177
3.1.5. Forster 공명 에너지 전달 현상 연구 180
3.1.6. 형광 분광학을 이용한 단백질의 동역학적 연구 183
3.1.6.1. 단백질 동역학 183
3.1.6.2. Trp fluorescence를 이용한 단백질의 국부 동역학적 연구 185
3.1.6.3. 단백질의 회전동역학 188
3.1.7. 단백질의 열역학적 안정성 193
제2절 연구방법 198
3.2.1. Wild type TNF-α의 평형 풀림 과정 연구 198
3.2.1.1. 시료 조건 198
3.2.1.2. 정류상태 형광 분광학 연구 198
3.2.1.3. Tyrosine과 Tryptophan간의 평균거리 계산 199
3.2.1.4. Wild type TNF-α의 시간분해 형광 소멸시간 연구 203
3.2.1.5. Hydrodynamic 계산 205
3.2.1.6. 시간분해 형광 비등방성 연구 208
3.2.2. W114F mutant와 wild type의 TNF-α의 평형 풀림 과정의 비교 연구 209
3.2.2.1. 시료 및 시약 209
3.2.2.2. 내재성 형광탐침을 이용한 wild type 과 W114F의 정류상태 형광분광학 209
3.2.2.3. Wild type과 W114F의 ANS 흡착성 비교 210
3.2.2.4. W114F Trp 잔기의 용매 접근도 210
3.2.2.5. Wild type과 W114F의 시분해 형광소멸 시간 측정과 W114F의 형광 비등방성 측정 210
3.2.2.6. W114F의 far-UV CD 스펙트럼 212
3.2.2.7. W114F의 젤 여과 크로마토그래피 212
3.2.2.8. Wild type과 W114F의 열역학적 안정성 계산 213
3.2.3. wild type/w114F mutant 되접힘 과정 연구 213
3.2.3.1. 형광을 이용한 되접힘 반응속도 측정 213
3.2.3.2. Far-UV CD를 이용한 되접힘 반응속도 측정 214
3.2.3.3. 되접힘 생성물에 대한 젤 여과 크로마토그래피 214
제3절 연구결과 215
3.3.1. Wild Type TNF-α의 평형 풀림 과정 연구 215
3.3.1.1. Forster 공명 에너지 전달 모델의 적용 215
3.3.1.2. Wild type 소수성 Tryptophan 잔기들의 용매접근도 218
3.3.1.3. Hydrodynamic 계산 221
3.3.1.4. Wild type 단백질 자체 및 내부의 동역학 연구 222
3.3.1.5. GdnHCl에 의해 유도되는 TNF-α wild type 단백질의 평형 풀림 과정의 제안 227
3.3.2. W114F와 wild type의 평형풀림 과정의 비교 229
3.3.2.1. 내재성 형광 탐침을 이용한 wild type과 W114F의 정류 상태 형광분광학 229
3.3.2.2. Wild type과 W114F의 ANS에 대한 흡착성 비교 240
3.3.2.3. W114F Trp 28 잔기의 용매 접근도 247
3.3.2.4. Wild type과 W114F의 시분해 형광 소멸 시간 248
3.3.2.5. W114F 의 형광 비등방성 측정 254
3.3.2.6. W114F의 far-UV CD 스펙트럼 260
3.3.2.7. W114F에 대한 젤 여과 크로마토그래피 264
3.3.2.8. Wild type과 W114F의 열역학적 안정성 비교 265
3.3.2.9. TNF-α의 평형 풀림 과정의 제안 266
3.3.3. Wild type과 W114F의 되접힘 반응 속도 연구 269
3.3.3.1. 형광을 이용한 되접힘 반응속도 측정 269
3.3.3.2. Far-UV CD에 의해 관찰된 Wild type 과 W114F의 되접힘 반응속도 277
3.3.3.3. 되접힘 생성물에 대한 젤 거름 크로마토그래피 281
3.3.3.4. TNF-α의 되접힘 과정의 제안 281
제4장 연구개발목표 달성도 및 대외 기여도 284
제5장 연구개발 결과의 활용계획 285
제6장 참고문헌 286
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Contents
I. Introduction 17
II. Composition of the Project 20
III. Details of the Projects 22
Process Development for large scale production and purification of M3S TNF 23
I. Introduction 30
II. Materials and Methods 31
1. Fermentation process 31
2. Purification process 31
III. Results 32
1. Contents of the study 32
2. Results of the study 33
3. Publications 34
IV. Conclusion 41
Studies on in Vivo Antitumor Activity of M3S TNFF 42
I. Introduction 50
II. Materials and Methods 53
1. Materials 53
2. Test animals and Maintenance 53
3. Experimental Methods 53
III. Results 55
1. Comparison of antitumor effects of M3S and Cisplatinum 55
2. The antitumor effects of M3S on SK-HEP 55
IV. Conclusion 56
V. References 57
Determination of tumor killing effect of M3S TNF-α in brain tumors 61
I . Introduction 68
II. "State of art" of the project 70
III. Results of the project 71
1. Cytotoxic effect of M3S TNF-α on various brain tumor cell lines 71
2. Development and application of brain tumor animal model 73
3. Pharmacokinetics of radiolabelled M3S TNF-α in brain tumor animal model 76
4. The antitumor effect of M3S TNF-α in 9L gliosarcoma rat animal model 77
5. The antitumor effect of M3S TNF-α C6 glioblastoma rat animal model 79
6. The antitumor effect of M3S TNF-α injected intratumorally in brain tumor model 80
7. Combination therapy of M3S TNF-α with chemotherapeutic agents or gene transfer[원문불량;p.81~82] 82
IV. Proposal for application 87
V. Plan for the Application of the Research Results 88
VI. References 89
Studies on in vivo Antitumor Activity of M3S TNF in combination with Taxol and Radiation Therapy 91
Chapter I. Introduction 96
Chapter II. Materials and Methods 97
Chapter III. Results 98
Chapter IV. Conclusion 101
Toxicity to Dogs by Repeated Intravenous Infusion for 4 Weeks 104
Three-dimensional structure determination of M3S for clinical trial 138
I. Introduction 145
II. Status of Research Development 145
III. Content and Result of the Research 146
IV. Accomplishment and Contribution of the Research 147
V. Plan for the Application of the Research Results 148
The structure-Functional Relationship of Tomor Necrosis Factor 151
Chapter 1. Introduction 163
Chapter 2. Current R & D Trends 168
Chapter 3. Contents and Results of R & D 170
Section 1. Subjects of R & D 170
3.1.1. Denatured state of proteins 170
3.1.2. Protein folding models 172
3.1.3. W114F mutant 176
3.1.4. Solvent accessibility of hydrophobic Trp residues 177
3.1.5. Applications of Forster energy transfer theory 180
3.1.6. Molecular dynamical studies using fluorescence spectroscopies 183
3.1.6.1. Protein dynamics 183
3.1.6.2. Local dynamics of proteins using Trp fluorescence 185
3.1.6.3. Rotational dynamics of proteins 188
3.1.7. Thermodynamical stability of proteins 193
Section 2. Experimental 198
3.2.1. Equilibrium unfolding pathway of Wild type TNF-α 198
3.2.1.1. Samples and conditions 198
3.2.1.2. Steady-state fluorescence spectroscopy 198
3.2.1.3. Calculations of average distances between tyrosine and tryptophan residues 199
3.2.1.4. Time-resolved fluorescence lifetime decay measurements of Wild type TNF-α 203
3.2.1.5. Hydrodynamic calculations 205
3.2.1.6. Time-resolved fluorescence anisotropy measurements 208
3.2.2. Comparative studies of equilibrium unfolding pathways of TNF-α W114F mutant and its wild type 209
3.2.2.1. Samples and reagents 209
3.2.2.2. Steady-state fluorescence spectroscopy of wild type and W114F mutant using intrinsic fluorescence 209
3.2.2.3. Comparison of ANS-adsorption abilities of wild type and W114F mutant 210
3.2.2.4. Solvent accessibility of W114F Trp residue 210
3.2.2.5. Time-resolved fluorescence lifetime measurements of wild type and W114F mutant and time-resolved fluorescence anisotropy measurements of W114F mutant 210
3.2.2.6. Far-UV CD spectra of W114F 212
3.2.2.7. Gel filtration chromatography for W114F mutant 212
3.2.2.8. Calculations of thermodynamical stabilities of Wild type and W114F mutant 213
3.2.3. Refolding pathways of wild type and W114F mutant 213
3.2.3.1. Refolding kinetics monitored by Trp fluorescence 213
3.2.3.2. Refolding kinetics monitored by Far-UV CD 214
3.2.3.3. Gel filtration chromatography for the refolding products 214
Section 3. Results 215
3.3.1. Equilibrium unfolding pathway of Wild type TNF-α 215
3.3.1.1. Applications of Forster energy transfer theory 215
3.3.1.2. Solvent accessibility of hydrophobic Trp residues 218
3.3.1.3. Hydrodynamic calculations 221
3.3.1.4. Tumbling and internal dynamics of Wild type protein 222
3.3.1.5. Suggestions of GdnHCI-induced equilibrium unfolding pathway of hTNF-α wild type 227
3.3.2. Comparative studies of equilibrium unfolding pathways of TNF-α W114F mutant and its wild type 229
3.3.2.1. Steady-state fluorescence spectroscopy of wild type and W114F mutant using intrinsic fluorescence 229
3.3.2.2. Comparison of ANS-adsorption abilities of wild type and W114F mutant 240
3.3.2.3. Solvent accessibility of hydrophobic Trp residues 247
3.3.2.4. Time-resolved fluorescence lifetime measurements of wild type and W114F 248
3.3.2.5. Time-resolved fluorescence anisotropy measurements of W114F mutant 254
3.3.2.6. Far-UV CD spectra of W114F 260
3.3.2.7. Gel filtration chromatography for W114F mutant 264
3.3.2.8. Calculations of thermodynamical stabilities of Wild type and W114F mutant 265
3.3.2.9. Suggestions of GdnHCl-induced equilibrium unfolding pathway of hTNF-α 266
3.3.3. Refolding pathways of wild type and W114F mutant 269
3.3.3.1. Refolding kinetics monitored by Trp fluorescence 269
3.3.3.2. Refolding kinetics monitored by Far-UV CD 277
3.3.3.3. Gel filtration chromatography for the refolding products 281
3.3.3.4. Suggestions of the refolding mechanism of TNF-α 281
Chapter 4. Status of achievement and expected contributions 284
Chapter 5. Expected applications of R & D results 285
Chapter 6. References 286