I. 제목
중간엽줄기세포의 동결방법 개발 및 유전학적 분석
II. 연구개발의 목적 및 필요성
최근 연구 결과들에 의하면 "냉동보관 후 1년 미만에서 7년까지 보존된 40개 제대혈을 대상으로 조사한 결과 생존세포로 알았던 세포들 중 30~70%가 실제로는 '초기 세포사'인 것으로 나타났다"고 밝혔다. 또 초기 세포사 상태에 있는 조혈모세포들을 분리한 다음 면역력이 떨어진 실험쥐에 이식한 결과 생착 능력이 거의 없는 것으로 나타났다고 덧붙였다. 일반적으로 제대혈의 경우 36시간 이내의 신선 제대혈만 냉동 보관하도록 권장하고, 일정 기준 이하(처리전 제대혈의 세포생존율이 80% 이하인 경우, 총 유핵 세포수가 5×108/ml개 미만인 경우 등)의 제대혈은 폐기하도록 규정하고 있다. 그러나 일부 보관업체에서는 이러한 기준을 지키고 있지 않은 상황에서 부적절한 동결보존 방법에 의하여 세포 생존율이 이것 밖에 되지 않는다면 심각한 문제가 아니라고 할 수 없다. 뿐만 아니라 이 결과는 단순한 생존율만을 조사한 것으로 유전자와 분자생물학적 분석은 비교하지 않은 것이므로 잠재적 위험은 더 높다고 할 수 있다. 따라서 새로운 동결방법을 개발하는 것이 필수적이다.
줄기세포는 장차 모든 조직으로 분화할 수 있는 가능성을 가지며 차후는 완전한 새로운 개체로도 발전 가능하다는 것이 가장 중요한 장점이다. 돼지는 사람과 비슷한 크기를 가지며 실험동물로서 비교적 저렴한 비용과 짧은 사육기간과 비용, 한 번에 많은 개체수의 생산 등과 같은 많은 잇점을 가지고 있으며 장기적으로 세포이식 실험시 관리가 수월한 장점도 가지고 있다. 이러한 목적을 위해서 유용성이 높은 돼지골수에서 간엽줄기세포를 분리하여 효과적인 동결방법을 개발하는 것이 필요하다. 간엽줄기세포는 중배엽성으로서 장차 뼈, 지방, 연골의 중배엽성 조직과 외배엽성인 신경으로도 분화가 가능함이 밝혀졌고 또한 제대혈에서도 중간엽 줄기 세포가 존재함이 밝혀짐으로서 그 유용성 무한하다. 그러나 중간엽 줄기세포는 아직 세포의 특이 마크가 완전히 밝혀져 있지 않아 장기간의 체외 배양을 유지하는데 현재 기술적으로 많은 문제가 있다. 따라서 적절한 동결기법을 개발하는 것이 필요하다. 현 재 대부분의 동결은 DMSO를 기본 동결보호제로 사용하여 수행되고 있으며 세포 동결 후 융해시 80% 이상의 생존율을 보인다고 보고된다. 그러나 이는 단순한 생존율로서 유전자 수준과 분자 생물학적 수준에서의 분석은 거의 전무한 것으로서 이는 차후 발생할 수 있는 문제점에 대한 고려가 전혀 없는 것이라 할 수 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 새로운 동결 방법을 개발하는 것은 필수적이며 중간엽 줄기세포 동결 전후의 정밀한 분석을 위한 중간엽 줄기세포의 동결방법 개발 및 유전학적 분석은 중요한 연구과제이다.
III. 연구개발의 내용 및 범위
1. 연구개발 사업 목표
본 연구는 돼지 골수 유래의 줄기세포를 분리 배양하고 줄기세포를 장기간 보존하는데 있어서 효과적인 mesenchyamal stem cell (MSC)의 동결방법을 개발하여 형태학적 특징뿐만 아니라 유전학적 분석과 분자생물학적 분석을 통한 안전성을 모니터링 하기 위함이다.
2. 연구 내용 및 범위
가. 줄기세포의 성공적인 분리 및 배양
(1) 돼지 골수 유래 줄기세포 분리 및 배양체계의 확립
(2) 분리된 MSC의 유전학적 검증
(3) 분리된 MSC의 형태학적 검증
(4) 분리된 MSC의 증식 능 검증
나. 줄기세포의 효과적인 동결
(1) 줄기세포의 Slow freezing 동결방법 개발 및 효과 검증
(2) DMSO 농도별 세포 동결 효과 비교 분석
(3) DMSO 농도에 따른 줄기세포의 생존율 분석
(4) DMSO 농도에 따른 줄기세포의 colony 형성 능력 분석
다. 1.5M ethylene glycol의 동결보호제로서 효과 및 세포 안정성 검사
(1) 돼지 골수 유래 줄기세포의 동결을 전후 한 줄기세포의 효율성 검증
(2) 줄기세포 동결전후에서 세포 표면 항원의 발현 검증
(3) 줄기세포의 동결을 전후한 세포 생사능 검사
(4) 줄기세포의 동결을 전후한 줄기세포 유지 유전자의 발현 분석
(5) 줄기세포의 동결을 전후한 세포사 검증
라. 줄기세포의 동결전후 세포수준 안전성 조사
(1) 줄기세포의 유지 유전자인 Nanog의 클로닝 및 발현 벡터 제작
(2) 줄기세포의 동결을 후 세포 분화능 검사
(3) 줄기세포의 지방세포로의 분화에 따른 지방세포 특이유전자의 발현 양상 분석
(4) 줄기세포의 동결을 전후 한 Nanog promoter의 MSC에서의 발현 활성 분석
IV. 연구개발결과
본 연구는 동물을 이용한 사람에게 적용 가능한 바이오 장기 생산과 동물 줄기세포를 이용 또는 응용하여 질환 치료 목적으로 사용하는데 있어서 효과적인 mesenchyamal stem cell (MSC)의 배양 기법을 개발하고 줄기세포의 유전학적 분석과 분자생불학적 분석을 통한 안전성을 모니터링하며, 장기간 보존을 위한 효과적인 동결방법을 개발하기 위하여 본 과제가 시도 되었다.
1. 연구 결과 요약
가. 돼지 골수유래 줄기세포 구축
살아 있는 돼지의 장골을 이용하여 골수를 분리하여 Ficoll paque plus를 사용하여 밀도구배 가장 상층의 세포를 분리하여 CO2 incubator에서 MSCs을 성공적으로 세포 배양하고 줄기세포로의 골수유래 성체줄기세포의 배양에 성공했다.
나. 줄기세포의 효과적인 Slow freezing 동결방법 개발
Kryo 360 동결기를 이용 -1℃/min 떨어뜨려 DMSO농도에 따른 동결의 효율성을 비교하기 위하여 세포 동결시 사용된 세포의 농도는 1×106/ml으로 조정하였고 각 vial 당 1ml을 담아 동결하였다. 동결된 MSCs들은 일주일에서 약 한달간 LN₂에서 보관 후 37℃에서 해동 후 세포의 생존율을 0.4% Trypan blue 용액을 사용하여 생존율을 조사한 결과, Fresh 군에서는 92%의 생존율을 보였고 5% DMSO군에서는 83.9%, 10% DMSO군에서는 77.6%로서 5%와 10% 두 군간에는 생존율에 있어 유의성은 없지만 5% DMSO 군에서 다소 높은 경향을 보였고 20% DMSO 군은 유의적으로 fresh 군과 5% DMSO 군보다 낮은 생존율을 보였다. 따라서 한 달 미만의 단기간 보존에 있어서는 5% DMSO군 또한 10% DMSO군과 비슷하거나 높은 생존율을 보임으로서 이들의 DMSO 농도는 돼지 골수 유래 줄기세포를 저장하는데 사용할 수 있는 동결 보호제로서 제시된다.
다. 줄기세포의 효과적인 동결방법 개발
MSCs의 성공적인 분리가 이루어졌으며 MSCs의 특징인 AP activity와 CD marks의 분석, transcript factors (Oct4, Nanog, Sox2)의 Immunocytochemistry와 RT-PCR을 통하여 분석한 결과 MSCs는 ESFs와 매우 유사한 특징을 가짐을 확인할 수 있었다. 동결시 DMSO의 농도에 따른 세포의 proliferation 효율을 확인하기 위하여 세포를 5×10⁴농도로 6 well에 seeding 한후 14일간 배양하여 각기 다른 농도의 DMSO로 동결된 MSCs의 colony-forming unit assay를 수행한 결과로서 Fresh군보다 동결된 군에서 유의적으로 낮은 colony수가 관찰되었고 5%와 10% 군간에는 유의성 없이 유사한 수를 보였다. 그러나 20% DMSO를 사용한 군에서는 유의적으로 적은 colony가 관찰되었다. 수행된 실험의 결과를 종합하여 보면 생존율과 proliferation능력은 5%와 10% DMSO군간에는 유의성이 없음이 관찰됨으로서 공히 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 이러한 결과는 임상 적용시, 동결 보호제의 부작용을 줄일 수 있는 혁신적인 방법이 될 수 있을 것으로 사려 된다.
라. 돼지 줄기세포 유지 유전자, Nanog의 발현 벡터 구축
돼지 골수 유래 줄기세포로부터 추출한 RNA를 이용하여 cDNA 합성으로 Nanog 발현 벡터를 구축 하였고 이상의 발현 벡터는 돼지 유래 줄기세포에서 아주 강하게 발현 하였으며 줄기세포를 이용한 동결 실험에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
마. 동결보호제의 농도차이에 의한 줄기세포 분석
이상의 실험 결과를 종합하여 보면 생존율과 proliferation능력은 5%와 10% DMSO 군간에는 유의성이 없음이 관찰됨으로서 공히 사용될 수 있음을 확인할 수 있었고 줄기세포로서의 유지 능도 비슷하여 동결 보호제로서 사용이 가능함을 알 수 있었다. 하지만 20%의 DMSO는 세포사의 신호가 강하게 나타났고 5%의 DMSO보다 호용성이 떨어지는 것으로 나타난다. 5% DMSO와 10% DMSO 돼지 유래 골수 줄기세포를 장 기관 보존하기위한 동결 보존제로서 사용 가능함이 밝혀졌다.
바. 동결보호제간의 차이에 의한 줄기세포 분석
Regular media와 10% DMSO, 1.5M ethylen glycol간에 줄기세포의 동결을 전후한 분석에서는 세포증식 능력은 차이를 나타내지 않았고, 줄기세포 유지 유전자인 Nanog Sox-2도 동결 전후에 비슷한 발현 양상을 보인다. 하지만 동결을 전후한 세포사의 차이는 정상배지 보다 10% DMSO, 1.5M EG에서 동결후의 세포가 약간 높게 나타난다. DMSO와 EG 그룹 간에는 차이가 없는 결론으로서 1.5M ethylen glycol 돼지 유래 골수 줄기세포에 대한 동결 보존제로서 사용할 수 있는 강력한 후보 물질이다.
사. 동결보호제 처리 후의 분화유도에 의한 줄기세포의 분화능력 분석
정상세포배지와 10% DMSO, 1.5M ethylen glycol간에 줄기세포의 동결을 전후한 분석에서는 지방세포로의 분화능력의 차이는 정상배지와 10% DMSO를 비교하여 실험한 결과 DMSO 배지에서 분화가 늦추어지는 경향이 있으며 지방세포 특이적 marker 유전자의 발현이 차이를 보이는데, Control 세포에서 분화유도 정도에 따라 PPAR gamma, PPAR alpha, aP2, C/EBP alpha의 발현은 증가하며, LPL도 분화 초기단계에서 발현이 증가한다. 이 결과와 다르게 10% DMSO에서의 동결 후 분화유도 시킨 세포에서 지방분화에 동반한 유전자 발현 양상은 control 세포와는 차이가 있으며, PPAR alpha, LPL, aP2의 발현 양상이 fresh 세포와 분화유도 시간에 따라 차이가 난다. 이는 동결을 전후하여 세포의 분화에 따른 영향이 존재하며 동결 보호제 줄기세포의 분화능에 영향을 끼치고 있음을 시사한다. 이상의 결과로서 동결보호제가 동결을 전후해서 줄기세포능에 영향을 미치고 있음을 확인할 수 있었다.
아. 동결보호제 처리에 의한 Nanog promoter의 전사 활성 분석
현 연구 과제를 수행 중 본 연구팀은 nanog 유전자의 5'-flanking region을 클로닝 하였고 이를 이용하여 세포동결에 줄기세포의 유지능을 알아보는 실험으로 정상세포배지와 10% DMSO 간의 promoter 활성 연구에서 nanog의 promoter construct을 MSC 내로 도입 시키고 정상세포와 DMSO에 의한 동결 후의 세포를 이용하여 전사활성을 분석한 결과 동결 전의 fresh한 세포에서 2kb의 promoter construct가 강한 promoter 활성을 나타내지만 DMSO에 의한 동결 후에는 1kb의 promoter 영역이 상대적으로 강한 활성을 나타내는바 동결을 전후한 nanog의 promoter 영역의 사용 가능 element가 변화하는 가능성이 있으며 promoter 영역의 DNA methylation의 변화, promoter와 결합하는 histone 단백질의 acetylation의 변화 등에 동반한 세포내의 가변성이 동결보호제에 의한 장기간 세포를 보존하는데 있어서 줄기세포로서의 능력을 변화 시킬 수 있는 가능성이 있으며, 이들은 향후 훌륭한 연구과제가 될 것으로 사료되며 동결에 전후한 세포의 능력 검정에 더 많은 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
V. 연구개발 결과의 활용계획
1. 추가연구의 필요성
가. 2년간 수행된 연구로 돼지 골수 유래 줄기세포 배양 체계를 확립했으며, 골수 유래 중 간엽 줄기세포를 장기간 보존하기 위하여 동결 보호제의 개발 및 검증에 대한 연구가 수행 되어졌다. 앞으로도 부족한 연구 부분과 단 기간의 연구 기간이라 중단된 실험 결과를 도출하기 위하여 타 연구와 연계하여 계속 할 예정이다.
2. 타 연구에의 응용
가. 이 결과를 토대로 향후 골수 유래 중간엽 줄기세포를 세포 치료 목적 , 바이오 장기 생산 목적 등을 위하여 장기간 세포 보존이 요구 될 시 이상의 결과들은 이용하여 타 연구에 수행에 적용 할 생각이다.
3. 연구결과의 활용계획
가. 돼지 골수 유래 줄기세포 배양 확립으로 동물 세포 배양 기법 확립
나. 줄기 세포 동결에 있어 얻어진 결과들은 줄기세포 장기간 보존에의 기준으로 가능
다. 돼지 유래의 유전자원 확보에 기여
라. 줄기세포 유지 유전자 과 발현 벡터 이용 가능
마. 동물 줄기세포 배양 기법 확립으로 기술력 선점
라. 동물 세포 응용 기술력을 사람 줄기세포 연구에 제공하여 산업화가 가능(국내 바이오 회사 및 제약회사)
바. 치료 목적용 줄기세포 장기간 보존을 위한 실험에의 기준점 제공
아. 돼지 줄기세포를 이용한 조직 특이세포로의 분화 및 바이오 장기 유전자원 확보