표제지
목차
Abstract 6
Ⅰ. 서론 7
Ⅱ. 연구내용 및 방법 8
1. 국내외 조류인플루엔자(AI) 진단체계 조사 8
2. 조류인플루엔자(AI) 표준진단체계 수립방법 8
3. 조류인플루엔자(AI) 검사 세부기술 최적화 8
가. 시료준비 8
(1) AI 바이러스 유전자 클론 8
(2) 분변 및 바이러스 시료 9
나. 프라이머 제작 및 검증 10
(1) AI 바이러스 진단 프라이머 및 프로브 10
(2) HA 타입 진단 프라이머 및 프로브 11
(3) NA 타입 진단 프라이머 및 프로브 12
다. Real time RT-PCR 조건 13
4. Conventional RT-PCR 방법 13
Ⅲ. 연구결과 및 고찰 14
1. 국내외 기관의 조류인플루엔자(AI) 진단체계 14
2. 조류인플루엔자(AI) 표준진단체계 수립 17
가. 표준진단체계 수립 전략 17
나. 표준진단체계 구축 18
(1) 표준진단체계 구축 18
(2) AI 검사 세부기술 최적화 18
3. Real time RT-PCR을 이용한 조류인플루엔자(AI) 검사법 확립 21
가. AI 바이러스에 대한 프라이머 적합도 평가 21
나. M 유전자 클론에 대한 프라이머 선행 실험 결과 21
다. 분리된 바이러스에 대한 real time RT-PCR 결과 21
4. Real time RT-PCR을 이용한 조류인플루엔자(AI) 검사법 적용 23
가. Real time RT-PCR 실험 조건 23
나. AI로 판명된 분변시료에 대한 real time RT-PCR 24
다. Conventional PCR 결과와의 비교 27
라. 실제 분변 시료 적용 결과 27
5. AI 바이러스 아형별 검사기술 27
가. HA 타입 결정 real time RT-PCR 27
나. SYBR Green을 이용한 NA 타입 결정 real time RT-PCR 30
다. Taqman 프로브를 이용한 NA 타입 결정 real time RT-PCR 31
Ⅳ. 결론 34
참고문헌 35
〈Table 1〉 List of clone for templates of PCR 9
〈Table 2〉 Summary of samples for rRT-PCR 10
〈Table 3〉 Primers and probes used for rRT-PCR amplification of M gene 11
〈Table 4〉 Primers and probes used for rRT-PCR of H5 and H7 type AI viruses 12
〈Table 5〉 Primers and probes used for rRT-PCR amplification of N1, N7, N8, N9 12
〈Table 6〉 PCR primer and hydrolysis probe sequences (OIE/USDA) 15
〈Table 7〉 PCR primer and hydrolysis probe sequences (EU) 15
〈Table 8〉 Summary of domestic and foreign AI diagnostic system 16
〈Table 9〉 The 8 fragments of genomic RNA of AI viruses 20
〈Table 10〉 Concordance of M primers with AI viruses isolated in 2008-2014, Korea 22
〈Table 11〉 Results of rRT-PCR using different primer sets 26
〈Table 12〉 List of fecal samples collected from Jeonbuk 29
〈Table 13〉 Results of SYBR green rRT-PCR for NA types 30
〈Table 14〉 Results of SYBR green rRT-PCR for AI viruses 31
〈Table 15〉 Oligonucleotide primers used for NA typing PCR amplification of diagnosis 32
〈Figure 1〉 The established procedure of diagnostic system for wildlife disease 17
〈Figure 2〉 The standard diagnostic system for avian influenza 19
〈Figure 3〉 Comparison of M primer of AI viruses isolated in 2008-2014, Korea 20
〈Figure 4〉 Results of M clone using rRT-PCR 23
〈Figure 5〉 Results of AI viruses using rRT-PCR 23
〈Figure 6〉 Comparison between the primer sets by rRT-PCR 25
〈Figure 7〉 Results of M gene using RT-PCR 27
〈Figure 8〉 Comparison of rRT-PCR with RT-PCR for fecal samples 28
〈Figure 9〉 Results of H5 and H7 primer sets using rRT-PCR 28
〈Figure 10〉 Comparison of rRT-PCR with RT-PCR for chonbuk samples 29
〈Figure 11〉 Results of NA primer using rRT-PCR 33