[표지]
요약문
목차
Abstract 14
I. 서론 15
II. 연구내용 및 방법 30
1. 단일검출법 개발 30
가. 단일검출법의 선행 연구 현황 30
나. 단일검출법 대상 이벤트 선정 30
다. 도입유전자 특성 자료조사 및 표준물질 확보 31
라. 이벤트 특이적 프라이머 제작 및 검출기법 확립 32
마. LM 작물 도입유전자의 주변염기서열 분석 35
바. 자체적인 최적검출 기법확립 37
2. 동시검출법 개발 38
가. 동시검출법의 선행 연구 현황 38
나. 동시검출법 대상 이벤트 선정 39
다. 유전정보 자료조사 및 표준물질 확보 39
라. 이벤트 특이적 프라이머 제작 및 검증 40
III. 연구결과 및 고찰 44
1. 단일검출법 개발 44
가. 표준물질로부터 유전체 DNA 순수분리 44
나. 제작한 프라이머 검증(내재유전자/LM 유전자 증폭) 45
다. 3개 LMO 이벤트의 검출기법 확립 47
라. 확립된 검출 기법의 민감도 분석 49
마. LMO 이벤트의 도입유전자 특성 및 모식도 52
바. 이벤트 별 도입유전자의 주변염기서열 분석 52
사. 자체 검출기법 개발 54
2. 동시검출법 개발 61
가. 표준물질로부터 유전체 DNA 순수분리 61
나. 제작한 프라이머 검증(내재유전자/LM 특이유전자 증폭) 61
다. 동시검출용(multiplex) 프라이머 선정 및 최적 동시검출 기법 확립 64
라. 확립된 multiplex-PCR 기법의 민감도 분석 67
IV. 결론 및 제언 70
1. 단일검출법 70
2. 동시검출법 71
참고문헌 73
부록 1. 연구결과활용 77
표 1. 국내 LM 작물별 수입량 18
표 2. 국내 위해성 심사 현황 19
표 3. 우리나라 LMO 위해성 심사 승인 현황(KBCH. 2016년 5월 기준) 19
표 4. 최근 국내 LMO 발견 현황 28
표 5. 단일검출대상 3개 LM 표준물질 32
표 6. 3개 작물을 검출하기 위한 프라이머 제작 33
표 7. LMO 검출 반응 시 이용한 PCR 반응 조건 34
표 8. 검출한계 실험에 이용한 유전체 DNA 농도 35
표 9. T-Blunt vector를 이용한 PCR 조건 36
표 10. 동시검출대상 6개 LM 표준물질 39
표 11. 내재유전자 검출하기 위한 프라이머 제작 40
표 12. 6개 LMO 이벤트의 도입유전자 구성정보 및 프라이머 위치 41
표 13. LM 콩 동시검출용 이벤트 특이적 검출 프라이머 제작 41
표 14. LM 옥수수 동시검출용 이벤트 특이적 검출 프라이머 제작 42
표 15. 각 작물별 내재유전자의 염기서열 정보 및 생성물 크기 46
표 16. 3개 LMO 이벤트의 도입유전자 특성 및 모식도 52
표 17. 3개 LMO 이벤트의 PCR 최종생성물 염기서열 분석 53
표 18. 검출 효율 향상을 위한 프라이머 제작 55
표 19. LM 옥수수 동시검출용 프라이머 선정 64
표 20. LM 옥수수 2개 이벤트 프라이머, 생성물 크기, 동시검출 최적 반응 농도 65
표 21. LM 콩 동시검출용 프라이머 선정 66
표 22. LM 콩 4개 이벤트 프라이머, 생성물 크기, 동시검출 최적 반응 농도 67
그림 1. 국가별 세계 GM 작물 재배 현황 16
그림 2. 국내 GM 작물 개발 현황 17
그림 3. 연도별 LMO 수입량 18
그림 4. LMO 단일검출법 보유 현황 31
그림 5. 단일검출대상 3개 LMO 표준물질. 32
그림 6. LM 작물 검출 실험을 위한 특이적 프라이머의 확보 및 보관 33
그림 7. LMO 검출을 위한 PCR 반응 조건 확립 34
그림 8. 분자 마커(왼쪽)와 전기영동(오른쪽) 장치 35
그림 9. 클로닝(cloning)에 사용한 T-Blunt vector 정보 36
그림 10. 형질전환을 위한 열충격장치와 진탕배양기 37
그림 11. LMO 동시검출법 보유 현황 38
그림 12. 동시검출대상 6개 LM 표준물질. 40
그림 13. LMO 동시검출을 위한 특이 프라이머의 확보. 43
그림 14. 시료 균질기. 44
그림 15. 표준물질로부터 정제한 유전체 DNA 44
그림 16. LMO로부터 정제한 유전체 DNA 확인 45
그림 17. Non-LM에서 정제한 유전체 DNA 확인 45
그림 18. 모니터링 시 발견된 시료와 표준시료에서의 캐놀라 내재유전자 CruA... 46
그림 19. 이벤트 특이 유전자 검증 47
그림 20. 5307 검출 조건 확립. 48
그림 21. MON87427 검출 조건 확립. 48
그림 22. DP-073496-4 검출 조건 확립. 49
그림 23. LM 옥수수 5307 민감도 분석 결과 50
그림 24. LM 옥수수 MON87427 민감도 분석 결과 51
그림 25. LM 캐놀라 DP-073496-4 민감도 분석 결과 51
그림 26. PCR 산물을 이용한 염기서열 분석 및 alignment 53
그림 27. 각 이벤트의 유전체 정보 검색 54
그림 28. 신규 프라이머를 이용한 5307 검출확인. 56
그림 29. 신규 프라이머를 이용한 MON87427 검출확인. 57
그림 30. 신규 프라이머를 이용한 DP-073496-4 검출확인. 58
그림 31. 5307 자체 검출기법 개발. 59
그림 32. MON87427 자체 검출기법 개발. 59
그림 33. DP-073496-4 자체 검출기법 개발. 60
그림 34. 동시검출대상 표준물질로부터 정제한 유전체 DNA 61
그림 35. 정제한 유전체 DNA 확인. 61
그림 36. 표준물질 유전체 DNA내 PCR을 이용한 내재유전자 증폭. 62
그림 37. 콩 MON87708 이벤트의 특이 유전자 증폭 검증 62
그림 38. 콩 MON87769 이벤트의 특이 유전자 증폭 검증 63
그림 39. 콩 DAS-68416-4 이벤트의 특이 유전자 증폭 검증 63
그림 40. 콩 DAS-44406-6 이벤트의 특이 유전자 증폭 검증 63
그림 41. 옥수수 DAS-40278-9 이벤트의 특이 유전자 증폭 검증 63
그림 42. 옥수수 MON87460 이벤트의 특이 유전자 증폭 검증 64
그림 43. LM 옥수수 2 이벤트의 PCR 반응을 이용한 프라이머 검증 64
그림 44. LM 옥수수 2개 이벤트의 동시검출을 위한 최적 PCR 반응 조건 및 결과 65
그림 45. LM 콩 4 이벤트의 PCR 반응을 이용한 프라이머 검증 66
그림 46. LM 콩 4개 이벤트의 동시검출을 위한 최적 PCR 반응 조건 및 결과 67
그림 47. LM 옥수수 duplex PCR 민감도 분석 결과 69
그림 48. LM 콩 tetraplex PCR 민감도 분석 결과 69