[표지]
요약문
목차
Abstract 13
I. 서론 14
1. 유전자변형생물체 작물 현황 14
2. 단백질 기능 이용 LMO의 현황 19
3. 해충저항성 단백질 기능 이용 LM 작물 24
4. 해충저항성 Vip 단백질 26
5. Vip 단백질의 특성 및 기능 27
6. 연구의 목적 및 방향 32
II. 연구내용 및 방법 35
1. B. thuringiensis 균에서 Vip3Aa 유전자의 분리 35
가. 살충 단백질 Vip3Aa 분리를 위한 B. thuringiensis 균 배양 35
나. PCR 방법으로 Vip3A 유전자 분리 35
다. Vip3Aa DNA T-Blunt 벡터에 cloning 및 염기서열 확인 35
2. 단백질 과발현용 벡터인 pET28a 벡터에 Vip3Aa 클로닝 36
3. BL21(DE3) 대장균에 pET28a-Vip3Aa 플라스미드 도입 37
4. Vip3Aa 재조합 단백질의 과발현 조건 실험 37
5. 대장균을 이용하여 Vip3Aa 단백질의 순수 분리 방법 확립 38
6. MALDI-TOF 분석을 이용한 Vip3Aa 재조합 단백질 동정 39
가. Mass Spectrometry를 이용한 단백질 동정 39
7. Vip3Aa 단백질의 분자·생물학적 특성 분석 39
가. Native-PAGE를 이용한 Vip3Aa 단백질의 분자형태 분석 39
나. FPLC를 이용한 Vip3Aa 단백질의 형태학적 분석 40
8. 국내 표적·비표적 곤충에 대한 Vip3Aa 단백질의 위해성 연구 40
가. 표적곤충을 이용한 Vip3Aa 단백질의 살충성 분석 40
나. 화랑곡나방 살충성 실험 40
다. 갈색거저리 살충성 실험 41
9. 국내 박테리아, 곰팡이에 대한 Vip3Aa 단백질의 위해성 연구 41
가. 박테리아, 곰팡이에 대한 Vip3Aa의 활성 분석 41
III. 연구결과 및 고찰 42
1. B. thuringiensis로부터 Vip3Aa 유전자 분리 및 단백질 과발현을 위한 유전자 클로닝 42
가. B. thuringiensis로부터 Vip3Aa 유전자 분리 42
나. Vip3Aa 단백질 과발현을 위한 유전자 클로닝 44
2. 대장균 내에서 Vip3Aa 재조합 단백질의 과발현 확인 46
3. Vip3Aa 단백질의 대량 순수분리를 위한 최적화 방법 구축 49
4. 순수 분리한 Vip3Aa 단백질의 mass spectrometry 동정 52
5. Vip3Aa 단백질의 형태학적 특성 분석 53
가. Native-PAGE를 이용한 Vip3Aa 단백질의 형태 분석 연구 53
나. FPLC를 이용한 Vip3Aa 단백질의 형태학적 분석 54
6. 국내 표적·비표적 곤충에 대한 Vip3Aa 단백질의 살충성 분석 55
7. 국내 박테리아, 곰팡이를 이용한 Vip3Aa 단백질의 환경위해성 평가 60
IV. 결론 및 제언 67
참고문헌 69
부록 72
표 1. 국가별 2014년, 2015년 LM 작물 재배 면적 15
표 2. 제초제저항성 LMO에 사용된 유전자, 유전자의 기원, 생산물 20
표 3. 해충저항성 LMO에 사용된 유전자, 유전자의 기원, 생산물 22
표 4. 국내 수입·유통이 승인된 Vip3A 유전자 이용 LMO 목록 31
표 5. 사용된 프라이머 리스트 및 PCR 조건 42
그림 1. 1996년부터 2015년까지 LM 작물의 세계 재배 현황 14
그림 2. 2015년 LM 작물 재배 면적 비교 17
그림 3. (A) 2011년~2015년까지 국내 수입된 LM 작물, (B) LM 작물별 2015... 18
그림 4. LMO 형질별 재배면적 19
그림 5. 인시류 유충의 중장 상피조직 막에서 Cry와 Vip 단백질들의 일반적인... 25
그림 6. Bt 단백질의 명명법. 26
그림 7. Vip 단백질 관계를 보여주는 아미노산서열에 기초한 분지도와 Vip 단... 27
그림 8. Vip 특이적 도메인 모식도 28
그림 9. Vip3A 단백질들의 염기서열 비교 29
그림 10. Vip3A 단백질의 활성 기작 모식도 30
그림 11. 국내 수입·승인된 LMO의 기능별 사용 현황 및 해충저항성 LMO의... 31
그림 12. 해충저항성 LMO의 환경위해성 연구 과제의 연차별 계획 34
그림 13. Vip3Aa 단백질의 환경 위해성 평가 대상 분류군의 구분 34
그림 14. PCR을 이용한 Vip3Aa 유전자 증폭. 43
그림 15. β-galactosidase를 이용한 색깔 선별과 콜로니 PCR을 통한 T-blunt... 44
그림 16. 단백질 발현용 pET28a 벡터 모식도(Novagen) 45
그림 17. 제한효소 절단을 통한 pET28a 벡터에 Vip3Aa 삽입 확인. 46
그림 18. IPTG 이용 Vip3Aa 재조합 단백질의 과발현 확인 48
그림 19. 대장균에서 Vip3Aa 단백질의 순수분리 모식도 및 분리한 순서 51
그림 20. 순수 분리한 Vip3Aa 단백질의 MALDI-TOF 분석 52
그림 21. Native-PAGE를 통한 Vip3Aa 단백질의 형태학적 분석 53
그림 22. FPLC를 이용한 Vip3Aa 단백질들의 형태 분석 54
그림 23. 가중나무껍질밤나방(a)과 미국흰불나방(b) 유충을 이용한 Vip3Aa 단... 56
그림 24. 화랑곡나방 유충을 이용한 Vip3Aa 단백질 살충성 테스트. 58
그림 25. 갈색거저리 유충을 이용한 Vip3Aa 단백질 살충성 테스트. 59
그림 26. pH 7.4 조건에서 박테리아의 환경위해성 실험. 61
그림 27. pH 5.2 조건에서 박테리아의 환경위해성 실험. 62
그림 28. pH 5.2 조건에서 곰팡이의 환경위해성 실험. 65
그림 29. 환경 위해성 평가를 위한 국내 생물상 66