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요약문
목차
Abstract 17
I. 서론 18
1. 연구배경 및 필요성 18
가. 유전자기반 LMO의 개요 18
나. RNAi 살충제(방제) 기술 이슈 분석 23
II. 연구내용 및 방법 26
1. dsRNA 발현 시스템 구축 연구내용 및 방법 26
가. dsRNA 발현 시스템 구축 26
나. dsRNA 발현 및 분리정제 방법 26
2. 곤충 사육 및 dsRNA 유전물질 처리 연구내용 및 연구방법 34
가. 국내 곤충사육현황 34
나. 먹이의 개념과 확보 35
다. 인공사료의 조건 35
라. 사육 중 오염방지 대책 36
3. 위해성 평가 대상종 선정의 연구내용 및 연구방법 38
가. LM 옥수수의 비표적절지동물에 대한 위해성 평가 방법 38
나. 국내 LMO 위해성 평가 관련 법규 분석 44
4. Tier 시스템 연구내용 및 연구방법 45
가. Tier I: 고농도 실내평가 45
나. dsRNA 위해성 평가시 Tier 1단계 고려사항 47
5. 위해성 평가대상종 선발 55
가. 생태적 기능군의 정의 56
나. 비표적절지동물의 구분(범주화) 56
6. 위해성평가 대상종의 특성 58
가. 돼지풀잎벌레(Ophraella communa, 초식곤충군) 58
나. 화랑곡나방(Plodia interpunctella, 초식곤충군) 59
다. 갈색거저리(Tenebrio molitor, 초식곤충군) 61
라. 꿀벌(Apis mellifera, 수분매개곤충군) 62
마. 초파리(Drosophila melanogaster, 분해자군) 64
7. dsRNA 위해성 평가를 위한 평가대상종 사육 및 실험방법 66
가. 돼지풀잎벌레 사육 및 실험방법 66
나. 화랑곡나방 사육 및 실험방법 67
다. 갈색거저리 사육 및 실험방법 68
라. 꿀벌 사육 및 실험방법 69
마. 초파리 사육 및 실험방법 71
8. dsRNA 환경 잔류 실험 72
가. dsRNA 처리를 위한 토양시료 72
나. dsRNA 처리방법 72
다. 토양시료내 total RNA 분리 및 RT-PCR 73
III. 연구결과 및 고찰 75
1. 목표유전자(Snf7)과 음성대조군(GFP) 유전자의 확보 75
2. 클로닝된 L4440 Snf7과 L4440 GFP의 확인 76
3. Snf7과 GFP dsRNA의 발현 확인 78
4. Snf7과 GFP dsRNA의 실시간 발현 양상 분석 78
5. Snf7과 GFP dsRNA의 최적 발현 조건 확립 79
6. 위해성 평가 대상종 선정 80
7. 비표적절지동물 위해성 평가 결과 82
가. 돼지풀잎벌레 위해성 평가 결과 82
나. 화랑곡나방 위해성 평가 결과 84
다. 갈색거저리 위해성 평가 결과 85
라. 꿀벌 위해성 평가 결과 86
마. 초파리 위해성 평가 결과 87
8. dsRNA 환경잔류 실험 결과 89
IV. 결론 및 제언 90
참고문헌 93
부록 1. 연구성과 102
표 1. 1990년대 중반 미국내 RNAi 기술을 이용하여 개발된 LM 작물 현황 22
표 2. Snf7과 GFP 유전자 증폭을 위한 프라이머 정보. 27
표 3. Snf7과 GFP 유전자 증폭을 위한 PCR 조건 28
표 4. PCR 증폭을 위한 반응액 조성 28
표 5. cDNA 합성을 위한 반응액 조성 31
표 6. cDNA 합성을 위한 PCR 반응 조건 32
표 7. qRT-PCR을 위한 프라이머 정보 33
표 8. 국내 용도별 곤충산업 시장 현황 및 전망 35
표 9. Singh가 개발한 곤충 사육용 사료의 조성 36
표 10. 미국의 기관별 LMO 관련 규정 40
표 11. LMO의 도입특성에 따른 규제기관 및 부처별 담당 역할 41
표 12. 아르헨티나의 농축수산식품부(SAGPyA) 산하 기관 및 역할 43
표 13. 캐나다 LMO 규제 기관 및 관련 규제 현황 45
표 14. 위해성 평가 실험대상종 선정 기준 57
표 15. 초파리 암수 구별법 66
표 16. cDNA 합성을 위한 반응액 조성 73
표 17. PCR 반응조건 74
표 18. dsRNA 위해성 평가를 위한 대상종 선정 결과 81
표 19. 갈색거저리 유충 무게 측정 결과 86
표 20. dsRNA 처리에 따른 꿀벌 누적 사망개체수 87
표 21. dsRNA 처리에 따른 꿀벌 일반 중독증상 87
그림 1. RNAi 생성 메커니즘 18
그림 2. dsRNA의 세포내 작용 기작 19
그림 3. Snf7 core의 X-ray 결정 구조 25
그림 4. L4440 vector 모식도. 29
그림 5. qRT-PCR반응 조건 모식도 34
그림 6. 해충저항성 LMO 위해성평가를 위한 평가대상종 선정 과정 55
그림 7. LM 옥수수에서 비표적절지동물의 기능군 정의 56
그림 8. 돼지풀잎벌레 변태과정. 59
그림 9. 화랑곡나방 변태과정. 60
그림 10. 갈색거저리 변태과정. 62
그림 11. 꿀벌의 변태과정. 64
그림 12. 초파리 암수구별 65
그림 13. 초파리 생활사 65
그림 14. 돼지풀잎벌레 사육 및 실험시료 처리. 67
그림 15. 화랑곡나방 사육 방법 및 실험시료 처리 방법. 68
그림 16. 갈색거저리 사육 방법 및 실험시료 처리 방법. 69
그림 17. 꿀벌 사육 방법 및 실험시료 처리 방법. 70
그림 18. 초파리 사육 방법 및 실험시료 처리 방법. 71
그림 19. 실험에 사용된 토양 시료 채취 지점 및 처리전 모습. 72
그림 20. Snf7과 GFP 유전자 염기서열. 75
그림 21. Snf7과 GFP Plasmid 모식도 및 PCR 결과. 76
그림 22. L4440 Snf7 염기서열 분석 결과. 77
그림 23. L4440 GFP 염기서열 분석 결과. 77
그림 24. L4440 Snf7과 L4440 GFP의 IPTG induction 확인. 78
그림 25. qRT-PCR을 이용한 GFP와 Snf7 dsRNA 발현 확인. 79
그림 26. IPTG 농도 및 온도에 따른 Snf7 dsRNA 발현 최적 조건 확립. 80
그림 27. 돼지풀잎벌레 누적 사망개체수(1차). 82
그림 28. 돼지풀잎벌레 누적사망률(1차). 83
그림 29. 돼지풀잎벌레 누적사망개체수(2차). 83
그림 30. 돼지풀잎벌레 누적사망률(2차). 83
그림 31. 화랑곡나방 누적사망개체수. 84
그림 32. 화랑곡나방 누적사망률. 84
그림 33. 화랑곡나방 시험물질별 사망개체수와 비율. 85
그림 34. 갈색거저리 시험물질별 유충 무게 86
그림 35. 초파리 암컷 한 마리당 시험물질별 융화수 88
그림 36. 초파리 암컷 한 마리당 시험물질별 우화수 88
그림 37. 토양내 Snf7의 잔류량 검증을 위한 PCR 증폭 조건. 89
그림 38. 토양 종류별 dsRNA 잔류량 확인. 89