표제지
목차
인사말 / 이유미 5
일러두기 7
제1장 잠재고등균류의 정의 및 조사배경 소개 12
1. 잠재고등균류의 정의 12
2. 조사배경 및 연구의 필요성 15
제2장 조사지 선정 및 토양 샘플링 방법 소개 19
1. 조사지 선정 19
1) 지리적 환경 조사 19
2) 식생 환경 조사 21
2. 토양 샘플링 23
1) 토양 샘플링 23
2) 샘플링 토양 처리 24
제3장 토양 물리ㆍ화학적 성질 분석 방법 소개 25
1. 산림토양의 물리적 성질 분석 26
1) 토성(Soil texture) 26
2) 토양 3상(Three phase of soil) 28
3) 토양비중(Density of soil) 29
4) 토양 공극 30
5) 토양수(수분함량) 30
2. 산림토양의 화학적 성질 분석 31
1) 토양 pH(수소이온농도지수, Hydrogen-ion concentration) 분석 31
2) 유기물함량(OM, Organic Matter) 및 전유기탄소(TOC, Total Organic Carbon) 분석 31
3) 전질소(T-N, Total nitrogen), 암모니아(NH₃) 및 질산(Nitric Acid, HNO₃) 분석 32
4) C/N율 분석 32
5) 총인(T-P, Total Phosphorus) 32
6) 치환성양이온(Exchangeable cation, Ca, Na, Mg, K) 33
제4장 Next Generation Sequencing(NGS; Mi-seq 등) 방법 소개 34
1. DNA 염기서열 분석 기술 34
2. 대표적 NGS 기법들 38
1) 로슈(Roche)의 454 시리즈 38
2) 일루미나(Illumina)의 GA, HiSeq, MiSeq 시리즈 39
3) 라이프 테크놀로지스(Life Technologies(ABI))의 SOLiD, 5500 시리즈 40
4) 제3세대 시퀀서(3rd Generation Seguencer, Next NGS) 42
5) 반도체 시퀀서(Semiconductor Sequencer) 43
3. NGS 기술의 전망 45
제5장 토양 샘플의 진균 NGS 데이터 분석 방법 소개 47
1. 데이터 전처리 작업 47
1) NGS 데이터 분석을 위한 소프트웨어 선택 47
2) 프라이머 및 메타정보 파일 제작 47
3) Paired-end 염기서열 결합(merge) 48
4) 시퀀스 de-multiplexing과 퀄리티 필터링 48
5) OTU 집단 조합과 키메라 염기서열 점검 48
6) OTU 대표 염기서열 선발 49
7) 대표 염기서열을 이용한 OTU 집단의 분자 동정 49
8)/7) 동정 결과 정리와 시각화 49
9)/8) 동정결과의 시각화 51
2. 알파 다양성지표 계산과 희박화곡선 그림작성 52
제6장 토양 내 고등균류 군집에 대한 통계분석 방법 및 예시자료 소개 54
1. 알파 다양성비교 분석 54
1) 알파 다양성 시각화 54
2) 통계분석 57
2. 베타 다양성 비교분석 57
1) 베타 다양성 시각화 57
2) 베타 다양성의 집단 차이 분석 59
3) 베타 다양성과 토양요소의 상관관계 분석 60
3. 우점속 비교 분석 61
1) 우점속의 시각화 61
2) 우점속과 토양요소의 상관관계 분석 64
제7장 토양 내 고등균류 분리 및 배양 방법 소개 66
1. 고등균류 분리 66
1) 고등균류 분리용 배지 조제 66
2) 토양 현탁액 조제 및 접종 68
3) 배양 및 순수 분리 69
2. 고등균류 배양 및 동정 70
1) 고등균류 배양 70
2) 고등균류 동정 70
3. 고등균류 보존 71
1) 활성상태 보존법 71
2) 휴면상태 보존법 71
제8장 참고문헌 74
[부록 Ⅰ] 2014~2017년도 [수목 및 산림 토양 내 잠재고등균류 발굴 연구(KNA1-1-14, 14-2)] 과제 수행내용 78
[부록 Ⅱ] 광릉숲 잠재고등균류 조사사이트에서 발생한 다양한 버섯들 153
판권기 3
표 2-1-1. 지형 구분 기준 20
표 2-1-2. 지형 구분 기준 21
표 2-1-3. 수관밀도 구분 기준 21
표 2-1-4. 경급 구분 22
표 3-1-1. 토양의 입경구분 26
표 3-1-2/표 2-1-3. 수관밀도 구분 기준 29
표 4-3-1/표 4-6-1. 다양한 NGS 플랫폼 종류 46
표 6-2-1/표 1. ADONIS 분석 결과 표 60
표 7-1-1. PDA(Potato Dextrose Agar)배지 조성 67
표 7-1-2. DRBC(Dichloran Rose-Bengal chloramphenicol Agar)배지 조성 67
표 7-3-1. 균류 보존법의 비교(Smith and Onions, 1994) 73
그림 1-1-1. 현재 생물 분류 도표 13
그림 1-1-2. 추정된 균류의 종(약 150만종)에서 기술된 균류의 종수는 전체의 5%정도(75,000 여종)이다 14
그림 1-1-3. 생태계내에서의 유전적다양성 연구는 표본을 통한 연구보다 높은 다양성을 보이기때문에 보다 높은 신뢰성과 다양한 해석이 가능하다 14
그림 1-2-1. 산림 토양에는 수목과 다양한 균류가 서로 네트워크를 형성하고 있다. 16
그림 1-2-2. 최근 논문(144건)을 바탕으로 파악된 메타지노믹스를 이용한 고등균류 발굴 분야(저자 국적별 분석) 17
그림 1-2-3. 최근 논문(144건)을 바탕으로 파악된 메타지노믹스를 이용한 고등균류 발굴 분야(분석대상 지역별 분석) 17
그림 1-2-4. 국적별 및 지역별 메타지노믹스를 이용한 고등균류 발굴 분야 분석 비교 18
그림 2-2-1. 토양 단면 23
그림 3-1-1. 국제토양학회법과 미국 농무성법의 토양삼각도 27
그림 3-1-2. 토양종류별 토양 3상 분포 29
그림 4-1-1. Maxam-Gilbert법. 일정한 양의 특정 DNA 절편을 단일가닥으로 분리한 후 5'-phosphate group을 32P로 라벨링하여 특정염기만을 자르는 화학물질을 첨가한다... 36
그림 4-1-2. Snager법에서 DNA를 구성하는 단위인 Deoxynuclotiede(dNTP) 분자구조의 -OH기에서 "O"가 제거된 dideoxynucleotied(ddNTP)를 이용하게 된다. 36
그림 4-1-3. Sanger법. 일정한 양의 특정 DNA절편을 단일가닥으로 분리후 4개의 시험관에 나누어 각 시험관에 primer를 넣어 DNA단일가닥에 PCR를 하게 되는데,... 37
그림 4-2-1. 파이로시퀀싱 분석 원리 39
그림 4-2-2. 일루미나 NGS 시퀀싱 작업흐름도 40
그림 4-2-3. SoLiD와 5500 시리즈의 시퀀싱 원리.(a) 하나의 read위에 primer(n)에서(n-4)까지 독립적으로 다섯 번 그림의 검은 점에 해당되는 위치의 염기들을 읽는다... 41
그림 4-2-4. 기존적인 PacBio 시퀀스 흐름도. 아답터(SMRTbells)를 각각의 증폭산물에 연결시켜 아령모양으로 만든다. 이렇게 만들어진 원모양의 주형을 시퀀싱하여... 42
그림 4-2-5. 반도체 시퀀싱. Ion PGM과 Ion Proton에서는 동일한 반도체 시퀀싱 기법을 사용하며 집적도가 다른 반도체 칩의 종류에 맞춰 한 번의 run으로 생산되는... 44
그림 5-1-1/그림 2. 계절과 토양층별 Phylum수준의 동정결과를 시각화 한 막대그래프. x축: 시료, y축: 상대적 비율 51
그림 5-2-1/그림 3. 희박화곡선 그림. x축: 염기서열 수, y축: mOTU 수 53
그림 6-1-1/그림 4. 알파 다양성지수를 계절집단으로 묶은 상자그림. x축: 계절, y축: 다양성 지수 값 55
그림 6-1-2/그림 5. 알파 다양성지수를 토양층 집단으로 묶은 상자그림. x축: 토양층, y축: 다양성 지수 값 56
그림 6-2-1/그림 6. 베타 다양성지수를 계절집단으로 묶어 분석한 NMDS 그림 58
그림 6-2-2/그림 7. 베타 다양성 지수를 토양층 집단으로 묶어 분석한 NMDS 그림 59
그림 6-2-3/그림 8. 진균 군집과 토양 요소와의 상관관계 그림 61
그림 6-3-1/그림 9. 우점속의 상대적 풍부도를 계절 집단으로 묶은 상자그림. x축: 계절, y축: 해당 속의 존재 비율 62
그림 6-3-2/그림 10. 우점속의 상대적 풍부도를 토양층 집단으로 묶은 상자그림. x축: 토양층, y축: 해당 속의 존재 비율 63
그림 6-3-3/그림 11. 우점속의 풍부도와 토양요소의 상관관계 그림. OM: 유기물함량, TN: 총질소, TP: 총인, C/N: 탄질비, Water: 수분함량 65
그림 7-1-1. 토양 순차 희석액 제조 및 접종 68
그림 7-1-2. 토양 희석액 접종 후 자라는 균총(DRBC 배지) 69
그림 7-2-1. 순수 분리된 고등균류 70
그림 7-2-2. 시퀀싱 크로마토그램 70
2014년도 과제 수행내용 정리 79
표 2-1/표 1-1. 소나무림내 토양의 각 시기 및 층별 이화학적 성분 분석 결과 79
표 2-2. 소나무림내 고등균류 자실체 채집 목록 80
표 2-3. 신갈나무림내 토양의 각 시기 및 층별 이화학적 성분 분석 결과 81
표 2-4. 광릉숲내 신갈나무림 고등균류 자실체 채집 목록 83
표 2-5. 점봉산 소나무림 조사지 시기별 토양 성분 분석 결과 86
표 2-6. 점봉산 소나무림 조사지 토양층별 이화학적 성분 분석 결과 86
표 2-7. 신갈나무림 조사지 시기별 토양내 이화학적 성분 분석 결과 89
표 2-8. 신갈나무림 조사지 토양층별 이화학적 성분 분석 결과 89
2015년도 과제 수행내용 정리 97
표 2-1. 광릉숲 전나무림의 토양 이화학적 성분분석 결과 97
표 2-2. 광릉숲내 전나무림 자실체 채집 목록 98
표 2-3. 광릉숲 서어나무림의 토양 이화학적 성분분석 결과 102
표 2-4. 광릉숲내 서어나무림 자실체 채집 목록 103
표 2-5. 점봉산 전나무림 조사지 토양 성분 분석 결과 107
표 2-6. 전나무림 토양 잠재균 다양성 지수 정보. Chao1(풍부도), Shannon(다양성), Equitability(균등도), Good's coverage(시퀀싱 충분도) 108
표 2-7. 서어나무림 조사지 토양성분 분석 결과 111
표 2-8. 서어나무림 토양 잠재균 다양성 지수 정보. Chao1(풍부도), Shannon(다양성), Equitability(균등도), Good's coverage(시퀀싱 충분도) 112
2016년도 과제 수행내용 정리 119
표 2-1. 점봉산 잣나무림 조사지 토양 이화학적성분 분석 결과 119
표 2-2. 점봉산 잣나무림 토양잠재균 다양성 지수 정보. 풍부도(Chao1), 다양성(Shannon), 균등도(Equitability), 시퀀싱 충분도(Good's coverage) 119
표 2-3. 점봉산 졸참나무림 조사지 토양 성분 분석 결과 121
표 2-4. 점봉산 졸참나무림 토양 잠재균 다양성 지수 정보. Chao1(풍부도), Shannon(다양성), Equitability(균등도), Good's coverage(시퀀싱 충분도) 122
표 2-5. 광릉숲 잣나무림의 토양 이화학적 성분분석 결과 124
표 2-6. 광릉숲 잣나무림 토양잠재균 다양성 지수 정보. 풍부도(Chao1), 다양성 지수(Shannon, Simpson), 시퀀싱 충분도(Good's coverage) 125
표 2-7. 광릉숲 졸참나무림의 토양 이화학적 성분분석 결과 126
표 2-8. 광릉숲 졸참나무림 토양잠재균 다양성 지수 정보. 풍부도(Chao1), 다양성 지수(Shannon, Simpson), 시퀀싱 충분도(Good's coverage) 126
2017년도 과제 수행내용 정리 133
표 2-1. 점봉산 낙엽송림 조사지 토양 성분 분석 결과 133
표 2-3. 점봉산 갈참나무림 조사지 토양 성분 분석 결과 135
표 2-4. 점봉산 갈참나무림 토양 잠재균 다양성 지수 정보. Chao1(풍부도), Shannon(다양성), Equitability(균등도), Good's coverage(시퀀싱 충분도) 136
표 2-5. 광릉숲 낙엽송림의 토양 이화학적 성분분석 결과 138
표 2-6. 광릉숲 낙엽송림 토양잠재균 다양성 지수 정보. 풍부도(Chao1), 다양성 지수(Shannon, Simpson), 시퀀싱 충분도(Good's coverage) 138
표 2-7. 광릉숲 갈참나무림의 토양 이화학적 성분분석 결과 139
표 2-8. 광릉숲 갈참나무림 토양잠재균 다양성 지수 정보. 풍부도(Chao1), 다양성 지수(Shannon, Simpson), 시퀀싱 충분도(Good's coverage) 140
표 2-9. 낙엽송 사이트 토양에서 분리된 균주목록 143
표 2-10. 갈참나무 사이트 토양에서 분리된 균주목록 144
표 2-11. 지의류에서 분리된 내생균(ELF) 148
2014년도 과제 수행내용 정리 81
그림 2-1. 시기별 소나무림 토양의 각 층별 고등균류 군집 비교. 4월에 75속으로 가장 다양한 속이 조사되었고, 10월에 73속, 8월에 69속, 12월에 20속이 각각... 81
그림 2-2. 시기별 신갈나무림 토양의 각 층별 고등균류 군집 비교. 4월에 99속으로 가장 다양한 속이 조사되었고, 10월에 87속, 8월에 75속, 12월에 39속이 각각... 82
그림 2-3. 각각의 소나무림 및 신갈나무림의 자실체와 토양고등균류상 비교. 소나무림에서 자실체는 13속, 토양고등균류상에서는 135속이 조사되었다... 84
그림 2-4. 소나무림 및 신갈나무림 자실체상 비교. 소나무림 및 신갈나무림에서 채집한 고등균류 자실체상을 비교하였을 때, 총 29속으로 소나무림에서 13속,... 84
그림 2-5. 소나무림 및 신갈나무림 토양고등균류상 비교. 소나무림 및 신갈나무림의 토양고등균류상을 비교하였을 때, 총 209속(133,167 reads)으로 소나무림에서... 85
그림 2-6. 소나무림 조사지내 토양에서 pyrosequencing으로 얻은 염기서열을 이용한 샘플링 충분도 분석 A: Pyrosequencing으로 얻은 OTU 수에 기반한 각 샘플별... 87
그림 2-7. 소나무림 조사지 토양내 잠재균상에 대한 베타 다양성 분석 결과. Bray-Curtis matrix를 이용한 NMDS 도표. A: 시기의 차이(적색: 5월, 녹색: 7월, 청색: 8월,... 88
그림 2-8. 신갈나무 조사지 토양에서 pyrosequencing으로 얻은 염기서열을 이용한 샘플링 충분도 분석. A: Pyrosequencing으로 얻은 OTU 수에 기반한 각 샘플별... 91
그림 2-9. 신갈나무림 조사지 토양내 잠재균상에 대한 베타 다양성 분석 결과. Bray-Curtis matrix를 이용한 NMDS 도표. A: 시기의 차이(적색: 5월, 녹색: 7월, 청색: 8월,... 92
2015년도 과제 수행내용 정리 99
그림 2-1. 광릉숲 내 전나무림 토양잠재균상의 시기별 및 토양층별 변화양상(문수준) 99
그림 2-2. 광릉숲내 전나무림 토양 잠재균상의 시기별 및 토양층별 GOTU 구성 101
그림 2-3. 광릉숲내 전나무림 자실체 및 토양 잠재균상 비교 101
그림 2-4. 광릉숲 내 서어나무림 토양잠재균상의 시기별 및 토양층별 변화양상 105
그림 2-5. 광릉숲 내 서어나무림 토양 잠재균상의 시기별 및 토양층별 GOTU 구성 105
그림 2-6. 광릉숲내 전나무림 자실체 및 토양 잠재균상 비교 106
그림 2-7. 전나무림 토양 잠재균상 시기별 분포 109
그림 2-8. 전나무림 토양내 잠재균상에 대한 베타 다양성 분석 결과. Bray-Curtis matrix를 이용한 NMDS 도표. A: 시기의 차이에 따른 잠재균상 비교 결과, B: 토양층... 110
그림 2-9. 전나무림 토양 이화학적 성분과 잠재균 군집의 상관관계에 대한 CCA 분석 결과. pH, 총유기탄소(TOC), 유기물 함량(O.M.), 전질소(TN), 전인산(TP),... 110
그림 2-10. 서어나무림 토양 잠재균상내 문(Phylum) 수준의 군집 구조 114
그림 2-11. 서어나무림 토양내 잠재균상에 대한 베타 다양성 분석 결과. Bray-Curtis matrix를 이용한 NMDS 도표. A: 시기의 차이에 따른 잠재균상 비교 결과,... 114
그림 2-12. 서어나무림 토양 이화학적 성분과 잠재균 군집의 상관관계에 대한 CCA 분석 결과. pH, 총유기탄소(TOC), 유기물함량(O.M.), 전질소(TN), 전인산(TP),... 115
2016년도 과제 수행내용 정리 120
그림 2-1. 점봉산 잣나무림 토양내 잠재균상의 베타 다양성 분석 결과. A: 시기별 차이, B: 토양층별 차이 120
그림 2-2. 점봉산 잣나무림 토양 이화학적 성분과 잠재균 군집의 상관관계에 대한 다차원척도 상관분석 결과. pH, 총유기탄소(TOC), 유기물함량(O.M.), 전질소(TN),... 120
그림 2-3. 점봉산 졸참나무림 토양내 잠재균상에 대한 베타 다양성 분석 결과. Bray-Curtis matrix를 이용한 NMDS 도표. A: 시기의 차이에 따른 잠재균상 비교 결과,... 122
그림 2-4. 점봉산 졸참나무림 토양 이화학적 성분과 잠재균 군집의 상관관계에 대한 다차원척도 상관분석 결과. pH, 총유기탄소(TOC), 유기물함량(O.M.),... 123
그림 2-5. 광릉숲 시기별 토양잠재균류의 구성변화(phylum-level) 127
그림 2-6. 광릉숲 잣나무림 및 졸참나무림의 토양층별 잠재고등균류 OTUs 비교 127
그림 2-7. 광릉숲 잣나무림 및 졸참나무림 토양의 잠재균류 비율 128
그림 2-8. 광릉숲 잣나무림과 졸참나무림의 잠재고등균류의 비교 128
그림 2-9. 광릉숲 잣나무림 토양내 잠재균상에 대한 NMDS 분석 결과(pH, p =0.092; NH4, p =0.053) 129
그림 2-10. 광릉숲 졸참나무림 토양내 잠재균상에 대한 NMDS 분석 결과(NO₃, p =0.088; C/N ratio, p =0.039) 129
2017년도 과제 수행내용 정리 134
그림 2-1. 낙엽송림 토양내 잠재균상에 대한 베타 다양성 분석 결과. Bray-Curtis matrix를 이용한 NMDS 도표. A: 시기의 차이에 따른 잠재균상 비교 결과, B: 토양층... 134
그림 2-2. 낙엽송림 토양내 잠재균상에 대한 베타 다양성 분석 결과. Bray-Curtis matrix를 이용한 NMDS 도표. A: 시기의 차이에 따른 잠재균상 비교 결과, B: 토양층... 134
그림 2-3. 갈참나무림 토양내 잠재균상에 대한 베타 다양성 분석 결과. Bray-Curtis matrix를 이용한 NMDS 도표. A: 시기의 차이에 따른 잠재균상 비교 결과, B: 토양층... 136
그림 2-4. 갈참나무림 토양 이화학적 성분과 잠재균 군집의 상관관계에 대한 다차원척도 상관분석 결과. pH, 유기물함량(OM), 전질소(TN), 전인(TP), 수분함량(Water),... 137
그림 2-5. 광릉숲 낙엽송림 및 갈참나무림의 토양층별 OTUs 분포 벤다이어그램 140
그림 2-6. 광릉숲 낙엽송림 및 갈참나무림의 시기별 토양내 잠재균상(Phylum-level) 141
그림 2-7. 광릉숲 낙엽송림 및 갈참나무림의 토양층별 잠재균상(Phylum-level) 141
그림 2-8. 광릉숲 낙엽송(위쪽) 및 갈참나무(아래쪽) 사이트 토양내 잠재균류 군집과 토양 화학적 성분간의 연관성 142
그림 2-9. 토양분리 고등균주 20종에 대한 온도별 배양실험 145
그림 2-10/그림 2-9. 지의류 내생균의 계통수(ITS 염기서열) 147
그림 2-11/그림 2-10. 배양온도에 따른 지의류 내생균의 생장률 150