[표지]
요약문
목차
Abstract 25
Ⅰ. 서론 26
1. 해충저항성 LMO 제작 방법 마련 및 구축 필요성 26
가. 해충저항성 유전자 이용 LM 작물 제작 방법 26
나. 국내 해충저항성 LM 개발 가능 작물 및 작물의 특성 30
다. 형질전환 해충저항성 LM 작물 선별 방법 마련의 중요성 33
2. LM 작물 기반 신규 해충저항성 LMO 위해성평가 마련의 필요성 35
가. 해충저항성 LMO 위해성평가 단계 및 문제점 35
나. 새로운 해충저항성 LMO 위해성평가 필요성 제시 39
3. 해충저항성 LMO 위해성평가를 위한 국내 생물종 선정의 중요성 40
가. 해충저항성 LMO 위해성평가용 국내 생물종 선정의 필요성 40
나. 해충저항성 LMO의 위해성평가를 위한 국내 생물종 탐색 43
Ⅱ. 연구내용 및 방법 48
1. 해충저항성 LMO 위해성평가를 위한 LM 구축 기술 개발 및 확보 48
가. 해충저항성 Vip3Aa 유전자 이용 국내 제작 가능 LM 작물 조사 48
나. 해충저항성 LM 작물 구축 방법 48
다. 해충저항성 LMO 발현산물 검증을 위한 항체 제작 49
2. 해충저항성 LMO 신규 위해성평가 기법 개발 및 적용 49
가. 해충저항성 LM 일시발현 작물 제작 방법 마련 49
나. 해충저항성 LM 일시발현 작물에서의 발현 산물 검증 50
3. 해충저항성 LMO 위해성평가용 국내 표적 생물종 후보군 선정 및 사육시스템 구축 50
가. 해충저항성 LMO 위해성평가용 표적 생물종 정보 수집 및 선정 근거 50
나. 담배거세미나방(Spodoptera litura) 유충을 이용한 해충저항성 단백질의 위해성 평가 방법 51
다. 담배거세미나방의 사육시스템 구축 54
4. 해충저항성 LMO 위해성평가용 비표적 생물종 후보군 선정 및 사육시스템 구축 55
가. 해충저항성 LMO 위해성평가용 비표적 생물종 정보 수집 및 선정 근거 55
나. 담배가루이(Bemisia tabaci)를 이용한 해충저항성 단백질의 위해성 평가 및 방법 56
5. 해충저항성 LM 작물 기반 생태위해성평가 실험 모델 제시 58
Ⅲ. 연구결과 및 고찰 59
1. 해충저항성 Vip3Aa 유전자 이용 해충저항성 LM 작물 제작 59
가. 해충저항성 LM 작물 제작을 위한 유전체 제작 59
나. 국내 생물종 위해성평가를 위한 LM 작물 구축 연구 60
다. 해충저항성 LM 작물 선별을 위한 항체 제작 62
2. 해충저항성 LMO 신규 위해성평가 기법 제시 63
가. 해충저항성 Vip3Aa 유전자 이용 일시발현 작물 구축 방법 마련 63
나. 일시발현 작물 내 Vip3Aa 유전자 분석 66
다. 일시발현 LM 작물에서 Vip3Aa 단백질 발현 및 발현량 분석 68
3. 해충저항성 LMO의 표적 생물종 가능성 확인을 위한 과독성 평가 70
가. 인공사료 급이를 이용한 위해성평가 70
나. 담배 및 콩잎을 이용한 위해성평가 76
다. Vip3Aa 단백질 일시발현 작물을 활용한 위해성평가 81
4. 해충저항성 LMO의 비표적 생물종 가능성 확인을 위한 과독성 평가 83
가. Vip3Aa 단백질 일시발현 작물을 활용한 위해성평가 83
5. 해충저항성 LMO 위해성평가 후보군의 사육시스템 구축 85
가. 담배거세미나방의 사육시스템 구축 85
나. 담배가루이의 사육시스템 구축 87
6. 해충저항성 LM 작물 기반 생태위해성평가 실험 모델 제시 89
Ⅳ. 결론 및 제언 91
참고문헌 94
부록 1. 연구성과 및 활용 103
표 1. 해충저항성 LMO 이용 위해성평가체계 및 고려사항(Tier system) 36
표 2. Vip3Aa 단백질 이용 고농도 위해성평가 국내 생물종 37
표 3. Vip3Aa 단백질 이용 국내 토양미생물 고농도 위해성평가 38
표 4. 해충저항성 LMO의 위해성평가 생물종 선정을 위한 고려사항 43
표 5. 비표적 생물종에 대한 해충저항성 LMO의 국내 실험실 내 영향 평가 연구 46
표 6. 비표적 생물종에 대한 해충저항성 LMO의 국내 포장 내 영향 평가 연구 46
표 7. 해충저항성 LMO에 대한 국내 표적 생물종 후보군 탐색 및 선정 기준 51
표 8. 해충저항성 LMO에 대한 국내 비표적 생물종 후보군 탐색 및 선정 기준 56
표 9. Vip3Aa 단백질 일시발현 작물제작 시 담배의 생장 단계 66
표 10. 일시발현 담배 잎에서의 측정된 Vip3Aa 단백질의 발현량 70
표 11. Vip3Aa 단백질이 함유된 인공사료를 섭식한 담배거세미나방 유충의 생존 개체 수 72
표 12. 저농도 Vip3Aa 단백질이 함유된 인공사료를 섭식한 담배거세미나방 유충의 전장 길이 75
표 13. Vip3Aa 단백질 도포된 담배 잎을 섭식한 담배거세미나방 생존 개체 수 78
표 14. Vip3Aa 단백질이 도포된 콩 잎을 섭식한 담배거세미나방 유충의 생존 개체 수 80
표 15. Vip3Aa 단백질 일시발현 담배 잎을 섭식한 담배거세미나방 유충의 치사 개체 수 81
표 16. Vip3Aa 단백질 일시발현 담배 잎을 섭식한 담배가루이의 생존 개체 수 84
표 17. 담배거세미나방 인공사료 조성 86
표 18. 담배거세미나방의 사육환경 86
표 19. 담배가루이의 사육환경 88
그림 1. Vip3Aa 유전자 도입 해충저항성 LM 작물 수입 승인 현황 26
그림 2. 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법 28
그림 3. 입자충격법을 이용한 형질전환 방법 29
그림 4. 전기충격법(원형질체 융합법)을 이용한 형질전환 옥수수 제작 기법 30
그림 5. 해충저항성 유전자 도입 LM 옥수수의 적용 32
그림 6. 해충저항성 유전자 도입 LM 콩 구축 방법 33
그림 7. 제초제 내성 LM 콩의 적용 33
그림 8. LM 작물 발현산물 검출을 위한 ELISA 실험법 34
그림 9. 담배를 이용한 특정 유전자 일시발현 방법 및 위해성평가 40
그림 10. Vip3Aa 유전자 이용 형질전환 콩 구축 방법 49
그림 11. 담배 및 콩잎을 이용한 실험실 내 과독성 평가 방법 53
그림 12. 담배거세미나방의 사육과정 55
그림 13. Vip3Aa 일시발현 작물 이용 담배가루이에 대한 위해성평가 시 개선사항 57
그림 14. LM 콩 구축을 위한 Vip3Aa 유전자 클로닝 59
그림 15. 형질전환 콩 구축을 위한 Vip3Aa 유전자 도입 아그로박테리움 선별 60
그림 16. 해충저항성 LM 콩 구축 진행 61
그림 17. LM 작물에서 Vip3Aa 단백질 검출을 위한 항체 제작 63
그림 18. 일시발현 LM 작물 구축을 위한 유전자 클로닝 64
그림 19. Vip3Aa 단백질을 일시 발현하는 담배의 제작 방법 65
그림 20. Vip3Aa 단백질을 일시 발현하는 담배 및 잎의 상태 66
그림 21. PCR 방법을 이용한 일시발현 담배 잎에 VipSAa 유전자 도입 확인 67
그림 22. qRT-PCR을 이용한 Vip3Aa mRNA level 확인 68
그림 23. 일시발현 조직에서 Vip3Aa 단백질 발현 확인 69
그림 24. Vip3Aa 단백질이 함유된 인공사료 섭식한 담배거세미나방 유충(1령)의 생존율 71
그림 25. 저농도 Vip3Aa 단백질이 함유된 인공사료에서 Vip3Aa 단백질에 대한 담배거세미나방 유충의 과독성 평가 73
그림 26. 저농도 Vip3Aa 단백질이 함유된 인공사료를 섭식한 담배거세미나방 유충의 전장 길이 비교 분석 74
그림 27. Vip3Aa 단백질이 도포된 담배 잎에서 담배거세미나방 유충의 과독성 평가 77
그림 28. Vip3Aa 단백질이 도포된 담배 잎을 섭식한 담배거세미나방 유충의 생존율 78
그림 29. Vip3Aa 단백질이 도포된 콩 잎에서 담배거세미나방 유충의 과독성 평가 79
그림 30. Vip3Aa 단백질이 도포된 콩 잎을 섭식한 담배거세미나방 유충의 생존율 80
그림 31. Vip3Aa 단백질 일시발현 담배 이용 담배거세미나방 유충의 위해성평가 82
그림 32. Vp3Aa 단백질 일시발현 담배 잎을 섭식한 담배거세미나방 유충의 생존율 83
그림 33. Vip3Aa 단백질 일시발현 담배 잎를 섭식한 담배가루이의 생존율 84
그림 34. 담배거세미나방의 사육시스템 확립 87
그림 35. 담배가루이의 생육단계 및 사육시스템 확립 89
그림 36. 해충저항성 LMO 국내 생물종 위해성평가를 위한 실험 모델 90