[표지]
요약문
목차
Abstract 19
Ⅰ. 서론 21
1. LM작물 개발 현황 21
가. 국내 개발 동향 21
나. LM 작물 재배 동향 22
다. 국내외 LMO 주요 이슈 동향 28
라. 국내 LMO 승인신고 및 수출 동향 32
2. LMO 표준물질 개발 및 보급 현황 37
가. Powder 표준물질 38
나. Genomic DNA 표준물질 38
다. Plasmid DNA 표준물질 39
3. LMO 검출법 개발 현황 및 목적 39
가. 단일검출법 개발 40
나. 동시검출법 개발 42
4. 바이오안전성의정서 당사국현황 43
가. 유럽연합(EU) 및 영국 동향 43
나. 미국 동향 47
다. 아시아 지역 동향 48
라. 남미 지역 동향 51
마. 아프리카 지역 동향 53
5. 국제공인시험기관(KOLAS)인정 추진 54
가. 개요 54
나. 관련 법 및 기준 57
다. 인정 분야 57
라. 국내 시험기관 인정 현황 59
마. 유전자변형 식품시험기관 인정을 위한 추가 기술요건 63
바. 기타 KOLAS 인정을 위한 추가 기술요건 64
6. 단백질 기반 LMO 검출법 64
가. Western blot 64
나. 효소결합면역흡착검사(ELISA) 65
다. 간이면역 검사키트(Lateral flow strip) 65
7. 연구 목표 66
가. 연구의 최종목표 66
나. 단일 및 동시검출법 개발 66
다. 국제공인시험기관 인정 66
라. 간이면역 검사키트 개발(1단계) 66
마. LMO 도입유전자 염기서열 확보 66
바. 생물다양성협약(CBD) 당사국 총회 참가 66
Ⅱ. 연구내용 및 방법 67
1. 국내외 LMO 검출 관련 자료 조사 등 연구 동향 파악 67
2. 단일검출법 구축 67
가. 단일검출법 대상 이벤트 선정 67
나. 단일검출법 대상 이벤트 표준물질 확보 69
다. 이벤트의 도입유전자 특성 70
라. 작물 및 이벤트 특이적 프라이머 제작 73
마. Genomic DNA 순수분리 73
바. 검출조건 확립 75
사. 이벤트 도입유전자 주변 염기서열 분석 76
아. 자체 검출법 개발 77
3. 동시검출법 개발 78
가. 동시검출법 대상 이벤트 선정 78
나. 유정정보 조사 및 표준물질 확보 78
다. 동시검출 프라이머 설계 및 검증 79
라. 동시검출법 검출한계 검증 85
마. 개발된 동시검출법의 예상 가능한 DNA 조합 검출 검증 85
4. 개발된 검출법의 LMO 모니터링 및 사후관리 연구 활용 86
가. 알팔파 동시검출법 현장 적용 86
나. 카놀라 동시검출법 효율 개선 및 현장 적용 86
다. 옥수수 동시검출법 효율 개선 및 현장 적용 86
5. 간이면역 검사키트 개발을 위한 LMO 내 도입유전자 확보(5종) 및 단백질 발현 87
가. LMO 도입유전자 염기서열 확보 및 유전자 클로닝 87
나. LMO 도입유전자 5종 클로닝 87
다. LMO 단백질 순수분리(CP4 EPSPS) 87
라. 도입단백질 특이적 항체 제작 및 항체 반응성 검토 88
Ⅲ. 연구결과 및 고찰 89
1. 단일검출법 개발 89
가. 단일검출법 프라이머 제작 89
나. 자체 단일검출법 검증 91
2. 동시검출법 개발 96
가. 동시검출법 프라이머 선정 96
나. 선정된 동시검출법 프라이머를 이용한 최적의 조합 선정 99
다. 개발된 동시검출법의 특이도 검정 100
라. 면화 동시검출법의 검출한계 분석 101
마. 개발된 동시검출법의 무작위 DNA 조합 검출 검증 102
3. 동시검출법 효율 개선 및 현장 적용 103
가. 알팔파 동시검출법 현장 적용 103
나. 카놀라 동시검출법 효율 개선 및 현장 적용 106
다. 옥수수 동시검출법 현장 적용 사례 108
4. 간이면역 검사키트 개발을 위한 LMO 내 도입유전자 확보(5종) 및 단백질 발현 110
가. LMO 도입유전자 염기서열 확보 및 유전자 클로닝 110
나. 제초제 저항성 LMO 도입단백질 순수분리 111
다. 도입단백질 특이적 항체 제작 위탁 의뢰 및 항체 확보 112
라. 확보한 항체 역가 확인 116
마. Epitope mapping 118
5. KOLAS 국제공인시험기관 인정 획득 119
가. 시험품질경영시스템 확립 119
나. 시험업무 시험경영시스템의 실행 120
다. 내부심사, 경영지표 및 시스템 보완 122
라. KOLAS 문서심사 및 현장평가 122
마. KOLAS공인시험기관 인정 획득 123
바. KOLAS공인시험기관 내부심사 123
Ⅳ. 결론 125
1. 단일검출법 개발 126
2. 동시검출법 126
3. 동시검출법의 모니터링 시료 분석 적용 127
4. 간이면역 검사키트 개발을 위한 LMO 내 도입유전자 확보(5종) 및 항체 확보 127
5. 국제공인시험기관 인정 추진 128
Ⅴ. 참고문헌 129
부록1. 133
부록2. 137
표1. 국내 LMO 연구개발 승인 현황 22
표2. 작물별 LMO 재배면적 23
표3. 주요 재배국 작물별 LMO 재배면적 비율 25
표4. 국가별 LM 작물 재배현황 26
표5. 국내 LMO 이벤트 승인 현황 33
표6. 국내 LMO 이벤트 수출 현황 37
표7. 환경부/국립생태원 단일검출법 개발 누적 현황 41
표8. 환경부/국립생태원 동시검출법 개발 누적 현황 43
표9. LMO 관련 EU 주요 규정 현황 44
표10. 바이오안전성의정서 당사국 현황 45
표11. EU LMO 환경방출 실험 현황 46
표12. 미국 환경방출 실험 현황 47
표13. 미국 유전자가위 산물 개발 사례 48
표14. 주요 아시아 지역 LM 작물 재배 현황 51
표15. KOLAS 인정 분야 57
표16. 국내 KOLAS 인정 시험기관 현황 60
표17. LMO 단일검출법 대상 이벤트 현황('20.11월 기준) 68
표18. 2020년 단일검출법 개발 대상 LMO 이벤트 표준물질. (A) 면화 GHB811,... 69
표19. 2020년 단일검출법 대상 4개 이벤트 정보 및 국내 수입승인 현황 71
표20. 2020년 단일검출법 개발을 위한 내재유전자 및 JRC 프라이머 염기서열 74
표21. 내재유전자 및 이벤트 검출 PCR 반응액 조성 75
표22. 2020년 동시검출법 개발 대상 LMO 표준물질 정보 79
표23. 2020년 면화 동시검출용 프라이머 정보 82
표24. 2020년 동시검출법 PCR 반응액 조성 84
표25. 개발된 동시검출법의 검출한계(LOD) 검증을 위한 표준물질 DNA 희석농도 85
표26. 동시검출법 효율 검증을 위한 무작위 CRM DNA 조합 85
표27. 2020년 이벤트 검출을 위한 자체 단일검출법 염기서열 91
표28. 2020년 면화 동시검출용 표준물질의 희석농도 99
표29. LM 알팔파 동시검출법으로 분석한 국내 자주개자리 표본 현황 104
표30. 제작된 항체의 반응성 시험 결과 117
표31. KOLAS 시험품질경영 주요 내용 120
표32. 2020년 LMO 검출 분야 숙련도 시험 결과 122
그림1. 주요국 LM 작물 재배 동향 23
그림2. 주요 재배국 LM 작물 재배면적 동향 27
그림3. 4대 LM 작물별 재배면적 변화 27
그림4. LM 작물 형질별 재배면적 변화 28
그림5. 정부 기관 LMO 안전관리 관련 성과 현황 32
그림6. 연도별 단일검출법 개발 현황(2011~2019) 41
그림7. 연도별 동시검출법 누적 개발 현황(2013~2019) 42
그림8. 한국인정기구 요건에 따른 시험기관 인정제도 구축 54
그림9. 국립생태원 시험성적서 의뢰 및 발급 절차 55
그림10. 시험성적서(예시)의 위변조 방지 장치 56
그림11. 간이면역 검사키트 작동 원리 65
그림12. 2020년 단일검출법 개발 대상 LM 표준물질. (A) 면화 GHB811,... 69
그림13. 4개 LM 이벤트의 도입유전자 특성 및 모식도 (A) GHB811 이벤트... 72
그림14. PCR 반응 조건 76
그림15. 2020년 동시검출법 개발 대상 LM 표준물질(좌측부터 GHB811, COT67B,MON88702) 및 Synbiocon(MON757) 78
그림16. 2020년 개선된 동시검출법 개발 방식 흐름도 80
그림17. 2020 동시검출법 대상 4개 면화 LMO 이벤트의 도입유전자 모식도... 81
그림18. 내재유전자 및 동시검출 PCR 반응 조건 84
그림19. 4개 LM 이벤트 자체 검출법 프라이머 위치 모식도. (A) GHB811... 90
그림20. 신규 프라이머를 이용한 GHB811 이벤트 검출 확인... 92
그림21. 신규 프라이머를 이용한 MON88702 이벤트 검출 확인. Lane 1 : 면화... 93
그림22. 신규 프라이머를 이용한 MZIR098 이벤트 검출 확인... 94
그림23. 신규 프라이머를 이용한 MS11 이벤트 검출 확인. Lane : 카놀라 내... 95
그림24. 동시검출법 개발을 위한 최적의 프라이머 조합 선정. (A) 프라이머 간... 98
그림25. 동시검출법 개발을 위한 9개 프라이머 조합의 PCR 결과 전기영동 사진 99
그림26. 면화 4개 이벤트의 동시검출개발 특이도 검증. 각 번호는 사용된... 100
그림27. LM 면화 동시검출법 검출한계 분석 결과 101
그림28. LM 면화 CRM 무작위 조합 분석 결과... 102
그림29. 2020년 LM 카놀라 동시검출 개발 결과 (A) 최적의... 103
그림30. 개발된 동시검출법의 91개 알팔파 시료에 적용한 결과... 105
그림31. 카놀라 7개 이벤트에 대한 동시검출 개발. (A) 최적의... 106
그림32. LMO 자연생태계 모니터링 결과 채집된 LM 카놀라 의심 시료에... 107
그림33. 옥수수 4개 이벤트의 동시검출 개발 (A) 4개 옥수수... 108
그림34. 개발된 동시검출법의 자연생태계 LMO 모니터링 시료에 적용 결과... 109
그림35. 국내 승인 LMO 도입단백질의 항체 제작을 위한 아미노산 서열 확보부터 재조합 단백질 분리까지의 과정 110
그림36. 순수분리한 Cp4 EPSPS 단백질의 (A) SDS-PAGE 및 (B) MALDI-TOF 분석 결과 111
그림37. 단클론항체 제작 및 스크리닝 과정 112
그림38. 하이브리도마 세포의 CP4 EPSPS에 대한 ELISA 분석 결과. (A) 1차 스크리닝... 116
그림39. 제작된 항체의 반응성 확인을 위한 western blot 결과 117
그림40. Cry3Aa 항체의 Epitope mapping 결과 118
그림41. 국립생태원 KOLAS 시험기관 조직도 119
그림42. 숙련도 시험 절차 121
그림43. 국립생태원 KOLAS 국제공인시험기관 인정서 및 표시판 123
그림44. KOLAS 국제공인시험기관 인정 언론 홍보 124