[표지]
요약문
목차
Abstract 23
I. 서론 24
1. 유전자변형생물체(Living Modified Organism) 개발 기술의 발전 및 개발 동향 24
2. LMO의 비의도적 유출 사례 및 위해성평가의 중요성 27
3. LM 작물 개발에 이용되는 신기술 종류 및 개발 동향 33
4. 국내외 신기술 적용 LMO 규제 동향 37
5. 신기술(RNAi) 적용 LMO의 국내 위해성평가 필요성 39
II. 연구내용 및 방법 42
1. 신기술 LMO 위해성평가 생물종 선정 방법 42
2. Coccinella septempunctata 위해성평가 가이드(안) 마련 42
3. Caenorhabditis elegans 위해성평가 가이드(안) 마련 43
4. 신기술 LMO 위해성평가 국내 생물종(2종) 선정 방법 43
가. 신기술 LMO 위해성평가 방법 및 항목 개발을 위한 국내 초식자군 선정 43
나. 신기술 LMO 위해성평가 방법 및 항목 개발을 위한 국내 포식자군 선정 44
5. 마커 유전자 이용 생물종 동정 44
가. 초식자(Myzus persicae) 종 동정을 위한 마커 유전자 탐색 및 검증 44
나. 포식자(C. septempunctata) 종 동정을 위한 마커 유전자 탐색 및 검증 46
6. 유전자 변화 분석을 이용한 생물종 위해성평가 47
가. 유전물질(dsRNA) 처리 생물종(2종) 장·단기 위해성 평가 47
나. RNA-seq 이용 LMO 유전산물(dsRNA) 처리 생물종(2종)의 유전자 변화 및 유전자 수준에서 위해성 여부 분석 48
7. 유전자 변화 정보 이용 DB(data base) 구축 52
가. 위해성평가 대상종인 C. septempunctata의 유전체 분석 결과를 단계적으로 DB화 작업 수행(Genome annotation, Functional annotation 분석 수행) 52
III. 연구결과 및 고찰 53
1. 신기술 LMO 국내 포식자군 및 토양생물군 평가종 선정 53
가. 신기술 적용 LMO 위해성평가를 위한 포식자군 선정 53
나. 신기술 적용 LMO 위해성평가를 위한 토양생물군 선정 53
2. 신기술 LMO 포식자군(Coccinella septempunctata) 위해성평가 가이드(안)개발 54
가. C. septempunctata dsRNA 유전물질 처리 위해성평가 가이드(안) 마련 55
3. 신기술 LMO 토양생물군(Caenorhabditis elegans) 위해성평가 가이드(안)개발 60
가. C. elegans ASTM E1272 가이드라인 분석(E1272 Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity Tests with the Nematode Caenorhabditis elegans) 61
나. C. elegans ISO10872 가이드라인 분석(Water quality — Determination of the toxic effect of sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda)) 69
다. C. elegans dsRNA 유전물질 처리 위해성평가 가이드(안) 마련 77
4. 신기술 기반 LMO 위해성평가를 위한 국내 생물종(2종) 후보 선정 83
가. 신기술 LMO 위해성평가 방법 및 항목 개발을 위한 국내 초식자군 선정 83
나. 신기술 LMO 위해성평가 방법 및 항목 개발을 위한 국내 포식자군 선정 87
5. 위해성평가 생물종 분류 마커 유전자 선정 및 검증 88
가. 초식자(M. persicae) 종 동정을 위한 마커 유전자 탐색 및 검증 88
나. 포식자(C. septempunctata) 종 동정을 위한 마커 유전자 탐색 및 검증 89
6. 국내 LMO 위해성 평가 생물종 2종 유전자 변화 분석 92
가. 유전물질(dsRNA) 처리 생물종(2종) 장·단기 위해성 평가 92
나. RNA-seq 이용 LMO 유전 산물(dsRNA) 처리 생물종(2종)의 유전자 변화 및 유전자 수준에서 위해성 여부 분석 96
7. 신기술 LMO 위해성평가 대상종 유전체 정보 DB구축 113
가. 위해성평가 대상종인 C. septempunctata의 유전체 분석 결과를 단계적으로 DB화 작업 수행(Genome annotation, Functional annotation 분석 수행) 113
IV. 결론 및 제언 117
참고문헌 123
부록 1 133
표 1. 최근 국내 유전자변형작물 개발 현황(2019) 25
표 2. 국외 유전자변형작물 개발 현황(2019) 26
표 3. 국외 유전자변형작물의 비의도적 유출 사례 30
표 4. LM 작물 위해성평가를 위한 Tier system 평가항목 및 고려사항(Directive 2001/18/EC) 32
표 5. LMO 개발에 이용되는 신기술 종류 33
표 6. 유전자가위 기술을 이용한 GM 어류 연구 사례 36
표 7. 신기술(유전자가위 등) LMO에 대한 각국의 규제 동향 38
표 8. RNAi 기반 LM 작물 위해성평가를 위한 Tier system 평가항목 및 고려사항 분석 40
표 9. DvSnf7 RNA의 MEEC, 비표적 생물체 연구에서 얻은 NOEC 및 추정 MOE[이미지참조] 41
표 10. COI(Cytochrome oxidase subunit I) primer sequence 45
표 11. 16S rRNA primer sequence 46
표 12. 12S rRNA primer sequence 47
표 13. LM 유전 산물에 대한 위해성 평가 실험 그룹 48
표 14. 딱정벌레목 국제 위해성평가 가이드라인 항목 분석 55
표 15. C. septempunctata 사육방법 56
표 16. 24시간 선충 독성 시험 조건 67
표 17. C. elegans의 국제 위해성평가 가이드라인 항목 분석 77
표 18. C. elegans 사육방법 79
표 19. C. elegans dsRNA 유전물질 처리방법 80
표 20. LMO 자연환경 위해성평가에 사용된 초식성 곤충과 포식성 곤충 84
표 21. 대표적인 LMO 위해성 평가 진딧물 종류 86
표 22. COI 유전자 이용 M. persicae 종 동정 결과 Sequence 분석 88
표 23. C. septempunctata 12S rRNA 유전자 PCR 생성물 sequencing 결과 91
표 24. Control 대비해서 T1에서 dsRNA조건에서 up-regulated된 값 99
표 25. Control 대비해서 T1에서 dsRNA조건에서 down-regulated된 값 100
표 26. Control 대비해서 T1에서 세 가지 조건에서 up-regulated 된 값 100
표 27. Control 대비해서 T1에서 세 가지 조건에서 down-regulated 된 값 101
표 28. Control 조건의 샘플에서 많이 발현된 유전자 30개 목록 103
표 29. Snf7 dsRNA 조건에서 많이 발현된 유전자 30개 목록[이미지참조] 104
표 30. GFP-T2 조건에서 거의 발현되지 않은 유전자 정보 105
표 31. GFP-T3 조건에서 거의 발현되지 않은 유전자 목록 106
표 32. Control 대비해서 T1에서 Snf7 dsRNA 조건에서 up-regulated 된 값[이미지참조] 109
표 33. Control 대비해서 T1에서 GFP조건에서 up-regulated 된 값 110
표 34. Control 대비해서 T1에서 세 가지 조건에서 up-regulated 된 값 110
표 35. Control 대비해서 T1에서 dsRNA조건에서 down-regulated 된 값 111
표 36. Control 대비해서 T1에서 세 가지 조건에서 down-regulated 된 값 111
표 37. Control 대비해서 T2에서 dsRNA조건에서 up-regulated 된 값 112
그림 1. 유전자변형생물체 개발 기술 동향 및 발전 24
그림 2. 국내 LMO 연구 및 개발 승인 현황(2019) 25
그림 3. 국가별 LMO 재배면적 및 재배작물 28
그림 4. 연도별 국내 LMO 수입량(2019) 28
그림 5. LMO 환경위해성평가 시스템(Tier system) 31
그림 6. Site-directed nucleases(SDN)를 이용한 genome-editing 35
그림 7. LMO 이벤트별 위해성평가 생물종 분석 44
그림 8. M. persicae genomic DNA 순도 확인 45
그림 9. RNeasy Kit 을 활용한 Total RNA 추출과정 모식도 48
그림 10. TruSeq RNA 라이브러리 제작과정 모식도 49
그림 11. de novo transcriptome 분석도구인 Trinity의 분석과정 모식도 51
그림 12. 신기술 LMO 국내 위해성평가 포식자군 선정(C. septempunctata) 53
그림 13. 신기술 LMO 국내 위해성평가 토양생물군 선정(C. elegans) 54
그림 14. C. septempunctata의 국내 위해성평가 가이드라인 항목 마련 60
그림 15. C. elegans의 Adult hermaphrodite 78
그림 16. C. elegans의 Male 78
그림 17. C. elegans의 국내 위해성평가 가이드라인 항목 마련 83
그림 18. LMO 유전산물(dsRNA)에 대한 위해성평가의 필요성 87
그림 19. COI 유전자 이용 M. persicae 종 동정 결과 NCBI Blast 분석 89
그림 20. 16S rRNA PCR 결과 90
그림 21. 12S rRNA PCR 결과 91
그림 22. Cs-12S rRNA 유전자 이용 C. septempunctata 종 동정 결과 NCBI Blast 분석 92
그림 23. M. persicae 기주식물(고추) 육묘 및 사육 조건 확립 93
그림 24. 유전물질(dsRNA) 처리 후 M. persicae 밀도(개체수) 조사 94
그림 25. Snf7 처리 후 M. persicae 밀도(개체수) 조사[이미지참조] 94
그림 26. Snf7 유전물질 처리 후 치사율 분석[이미지참조] 95
그림 27. M. persicae을 이용한 유전자 변화 분석 96
그림 28. M. persicae의 샘플간 및 처리 시간에 따른 유전자 발현 형태 분석 97
그림 29. M. persicae의 샘플 간 및 처리 시간에 따른 유전자 발현 형태 분석 98
그림 30. 세 가지 그룹으로 나눈 시간대별 실험 조건 별 차이가 나는 유전자 발현 분석 99
그림 31. C. septempunctata을 이용한 유전자 변화 분석 RNA 분리(Quality Control) 101
그림 32. C. septempunctata의 샘플간 및 처리 신간에 따른 유전자 발현 형태 분석(Scatter plot) 102
그림 33. C. septempunctata의 샘플간 및 처리 시간에 따른 유전자 발현 형태 분석(Volcano plots) 107
그림 34. 3 가지 그룹으로 나눈 시간대별 실험 조건 별 차이가 나는 유전자 발현 분석 108
그림 35. 데이터베이스 메인화면 113
그림 36. 데이터베이스 상에 ShortRead Dataset 요약정보 및 상세정보 화면구현 114
그림 37. 데이터베이스 상에 Transcriptome Browser 요약정보 및 상세정보 화면 114
그림 38. 데이터베이스 상에 Transcriptome InterPro Browser 요약정보 화면 115
그림 39. 데이터베이스 상에 BLAST History Browser 및 BLAST Browser 화면 116