표제지
목차
요약문 3
Abstract 18
Ⅰ. 서론 20
Ⅱ. 연구내용 및 방법 25
1. 구상나무 진단마커 유전자 활용 적응조건 연구 25
가. 구상나무 진단마커 유전자 발현도 증진 식물생장조절물질 처리조건 확립 25
(1) 처리농도에 따른 발현도 분석 25
(가) 연구내용 25
(나) 연구방법 25
(2) 처리시간에 따른 발현도 분석 27
(가) 연구내용 27
(나) 연구방법 28
(3) 식물생장조절물질 처리방법 개발 30
(가) 연구내용 30
(나) 연구방법 30
나. 연구결과 기반 진단마커유전자의 발현 유도 식물생장조절물질 탐색 연구 33
(1) 연구내용 33
(2) 연구방법 34
2. 자생지 내 구상나무 진단마커 유전자의 발현도 비교연구 36
가. 연구내용 36
나. 연구방법 36
3. 구상나무 진단마커 유전자의 기능 및 기작 연구 38
가. AkNAC19의 건조스트레스 저항성 기능 연구 38
(1) 연구내용 38
(2) 연구방법 39
(가) c142609_g1_i1 진단마커 유전자의 명명 39
(나) 건조 스트레스에 따른 진단마커 유전자의 발현 분석 39
(다) ABA 호르몬에 따른 진단마커 유전자의 발현 분석 42
나. 신규 진단마커 유전자의 기능 연구를 위한 형질전환 운반체 제작 43
(1) 연구내용 43
(2) 연구방법 43
4. 구상나무 배아줄기세포의 대량증식 방안 연구 49
가. 연구내용 49
나. 연구방법 49
Ⅲ. 연구결과 및 고찰 54
1. 구상나무 진단마커 유전자 활용 적응조건 연구 54
가. 구상나무 진단마커 유전자의 발현도 증진을 위한 식물생장조절물질 처리조건 확립 54
(1) 처리농도에 따른 발현도 분석 54
(2) 처리시간에 따른 발현도 분석 58
(3) 식물생장조절물질 처리방법 개발 64
나. 연구결과 기반 진단마커유전자 발현 유도 식물생장조절물질 탐색 연구 71
(1) 식물생장조절물질 IAA 처리에 의한 발현도 분석 71
(2) 식물생장조절물질 GA 처리에 의한 발현도 분석 75
(3) 식물생장조절물질 ABA 처리에 의한 발현도 분석 79
(4) 식물생장조절물질 Ethylene 처리에 의한 발현도 분석 83
(5) 식물생장조절물질 MeJA 처리에 의한 발현도 분석 87
(6) 식물생장조절물질 SA 처리에 의한 발현도 분석 91
(7) 식물생장조절물질 KIN 처리에 의한 발현도 분석 95
(8) 식물생장조절물질 BRZ 처리에 의한 발현도 분석 99
(9) 식물생장조절물질 PUT 처리에 의한 발현도 분석 103
(10) 식물생장조절물질 SPD 처리에 의한 발현도 분석 107
(11) 식물생장조절물질 SPM 처리에 의한 발현도 분석 111
(12) 식물생장조절물질 T-spm 처리에 의한 발현도 분석 115
2. 자생지 내 구상나무 진단마커 유전자의 발현도 비교연구 119
가. 한라산 기상변화에 따른 생육 양호 및 취약 지역 시료의 발현도 비교 119
(1) 4월과 7월, 생육 양호 및 취약 지역 시료의 진단마커 발현도 비교 119
나. 지리산의 지역별 생육 양호 및 취약 지역 시료의 진단마커 발현도 비교 128
(1) 세석 및 반야봉지역 생육 양호 및 취약 지역 시료의 진단마커 발현도 비교 128
3. 구상나무 진단마커 유전자의 기능 및 기작 연구 133
가. AkNAC19 유전자의 기능 및 기작 연구 133
(1) NAC29와 NAC19 유전자의 아미노산 서열 분석 133
(2) 건조 스트레스 처리에 따른 표현형 분석 136
(3) ABA 처리에 따른 식물체의 발아율 관찰 149
나. 신규 진단마커 유전자의 기능 연구를 위한 형질전환 운반체 제작 153
(1) 신규 유전자의 아미노산 서열 분석 153
(2) 식물 형질전환용 운반체의 제작 166
(3) 신규 유전자 기능에 관한 정보 분석 168
4. 구상나무 배아줄기세포의 대량증식 방안 연구 170
가. 구상나무 배아줄기세포의 대량증식 170
Ⅳ. 결론 178
1. 결론 178
2. 향후계획 179
3. 기대효과 180
참고문헌 181
판권기 193
표 1. 연도ㆍ계절별 강수량(mm) 비교(기상청 기상자료개방포털, 2021) 21
표 2. 자생지내 구상나무 진단마커 유전자의 발현도 분석을 위한 프라이머(qRT-PCR용) 정보 38
표 3. 애기장대의 건조 스트레스 관련 유전자의 qRT-PCR용 프라이머 정보 42
표 4. 구상나무의 건조스트레스 처리에 따른 발현 전사체의 검색 결과 및 명명 47
표 5. 진단마커 유전자의 분석에 사용된 프라이머 정보 48
표 6. 구상나무 배아줄기세포에 처리한 식물생장조절물질(13종) 정보 52
표 7. 앱시스산 처리농도에 따른 AkNAC19, AkMPK6 진단마커유전자의 발현도 값 및 통계 분석 57
표 8. 0.2 mM 앱시스산, 살리실산 및 자스몬산의 처리시간에 따른 AkNAC19, AkMPK6, AkEFP 진단마커유전자의 발현도 값 및 통계 분석 62
표 9. 증류수로 진공처리 후, AkNAC19, AkMPK6, 및 AkEFP 유전자의 발현도 값 및 통계 분석 67
표 10. 80 파스칼 세기로 진공처리 후, AkNAC19, AkMPK6, 및 AkEFP 유전자의 발현도 값 및 통계 분석 70
표 11. IAA 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 74
표 12. GA 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 78
표 13. ABA 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 82
표 14. Ethylene 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 86
표 15. MeJA 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 90
표 16. SA 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 94
표 17. KIN 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 98
표 18. BRZ 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 102
표 19. PUT 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 106
표 20. SPD 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 110
표 21. SPM 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 114
표 22. T-spm 처리 후, 진단마커유전자(8종)의 발현도 값 및 통계 분석 118
그림 1. 지리산국립공원 구상나무군락 내 ha당 생육목, 후계목, 고사목 개체수. A, 지리산국립공원 세석지역의 구상나무군락 내 ha당 생육목, 후계목, 고사목 개체수... 22
그림 2. 지리산국립공원 반야봉의 연평균 기온 및 연 최고 최저기온 변화(국립공원 기후변화 모니터링, 2020) 23
그림 3. 진단마커 유전자의 발현이 증진되는 조건 탐색에 사용된구상나무(국립생태원 내 한반도 숲). A, 구상나무 전체 모습. B, 구상나무 소지 26
그림 4. 시간에 따른 구상나무 잎에 호르몬 처리 실험(CON; 증류수). 호르몬 처리 전 후의 구상나무 잎 사진 29
그림 5. 진공데시케이터를 사용한 진공처리 방법. A, 진공데시케이터에서 진공 처리하는 모습. B, 106 파스칼로 2분과 5분 동안 진공처리 후 수면 아래로 구상나무... 31
그림 6. 진공데시케이터를 사용하여 호르몬 처리. A, 진공처리 직후의 모습. B, 80, 106파스칼의 세기로 2분 처리한 후, 구상나무 잎이 가라앉은 모습 32
그림 7. 구상나무에 식물생장조절물질(12종) 처리의 실험 모식도 35
그림 8. 한라산 구상나무 구과 사진. A, 구과가 맺힌 한라산 구상나무. B, 구과 단면 49
그림 9. 한라산 구상나무 구과에서 채취된 미성숙 배. A, 채취된 구상나무 미성숙 배의 현미경 사진. B, ½MS+TDZ 2 mg/L 배지에 치상된 구상나무 미성숙 배 50
그림 10. 구상나무 배아줄기세포의 확보를 위한 연구과정 모식도 53
그림 11. 앱시스산의 농도별 처리 후, AkNAC19 진단마커유전자의 발현도 분석. A, 24시간 처리. B, 48시간 처리 55
그림 12. 앱시스산의 농도별 처리 후, AkMPK6 진단마커유전자의 발현도 분석. A, 24시간 처리. B, 48시간 처리 56
그림 13. 0.2 mM 앱시스산, 살리실산 및 자스몬산의 시간별 처리 후, 진단마커 유전자 발현 결과 분석. A, AkNAC19 유전자 발현 결과. B, AkMPK6 유전자 발현 결과 60
그림 14. 증류수를 진공처리 후, 진단마커유전자 발현 분석. A, 80 파스칼 압력으로 2분 처리. B, 106 파스칼 압력으로 2분 처리 66
그림 15. 구상나무 잎에 앱시스산을 진공처리 후, 진단마커유전자의 발현도 분석. 80 파스칼의 압력으로 2분과 5분간 진공처리. A, AkNAC19 진단마커 유전자의 발현... 68
그림 16. IAA 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 72
그림 17. GA 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 76
그림 18. ABA 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 80
그림 19. Ethylene 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 84
그림 20. MeJA 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 88
그림 21. SA 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 92
그림 22. 식물생장조절물질 KIN 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1 mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다... 96
그림 23. BRZ 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 100
그림 24. PUT 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 104
그림 25. SPD 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 108
그림 26. SPM 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 112
그림 27. T-spm 처리 후, 진단마커유전자의 발현 분석. 처리농도는 0.1, 1mM이며, CON은 대조구로 증류수를 사용하였다. A, AkNAC19 진단마커유전자... 116
그림 28. 4월 한라산 구상나무의 지역별 진단마커 발현도 비교를 위한 qRT-PCR 결과 4월 한라산 구상나무의 양호와 취약 지역에서 진단마커유전자의 발현을 비교... 120
그림 29. 7월 한라산 구상나무의 지역별 진단마커 발현도 비교를 위한 qRT-PCR 결과 7월 한라산 구상나무의 양호와 취약 지역에서 진단마커유전자의 발현을 비교... 122
그림 30. 3월과 6월의 한라산 양호 및 취약지역의 최고기온. A, 3월 한라산 양호지역(남벽)의 최고기온. 최고기온 평균은 10.5℃. B, 3월 한라산 취약지역... 125
그림 31. 3월과 6월의 한라산 양호 및 취약지역의 일강우량. A, 3월 한라산 양호지역(남벽)의 일강우량. 총 강우량은 497 mm. B, 3월 한라산 취약지역(영실)... 126
그림 32. 지리산의 4월과 5월의 최고기온과 일강우량. A, 4월 지리산의 최고기온. B, 5월 지리산의 최고기온. C, 4월 지리산의 일강우량. D, 5월 지리산의 일강우량 129
그림 33. 지리산 세석지역 구상나무의 진단마커 발현도 비교를 위한 qRT-PCR 결과 지리산 세석지역 구상나무의 양호 및 취약 지역에서 진단마커유전자의... 130
그림 34. 지리산 반야봉지역 구상나무의 진단마커 발현도 비교를 위한 qRT-PCR 결과 지리산 반야봉지역 구상나무의 양호 및 취약 지역에서 진단마커유전자의... 131
그림 35. c142609_g1_i1 유전자의 식물체간의 NAC29 아미노산 서열 비교 분석 1, Abies koreana(AkNAC19). 2, Picea sitchensis(싯카 가문비나무... 134
그림 36. c142609_g1_i1 유전자의 식물체간의 NAC19 아미노산 서열 비교 분석 1, Abies koreana(AkNAC19). 2, Picea sitchensis(싯카 가문비나무... 135
그림 37. 모델식물의 종자 발아 관찰. A, 애기장대 종자(휴면중인 종자). B, 유근이 나온 애기장대 종자(발아중인 종자) 136
그림 38. Col-0 및 AkNAC19 과발현 종자의 Mannitol 배지에서 발아 관찰 A, 대조군 ½MS 배지. B, 비교군 250mM Mannitol이 첨가된 ½MS 배지... 138
그림 39. Col-0 및 AkNAC19 과발현 종자의 Mannitol 배지에서 발아율 관찰(4일차) A, 대조군 ½MS 배지에서 종자의 발아율. B, 비교군 250mM... 139
그림 40. Col-0 및 AkNAC19 과발현 식물체의 Mannitol 배지에서 생존력 분석 A, 대조군인 ½MS 배지에서 28일차 사진. B, 비교군인 300mM... 141
그림 41. Col-0 및 AkNAC19 과발현 식물체의 Mannitol 배지에서 생존율 분석 A, 대조군 ½MS 배지에서 28일차 생존율. B, 비교군인 300mM... 142
그림 42. 토양에서 건조 스트레스 반응 분석 촬영된 사진은 각각 3주간 키운 뒤 사진, 2주간 건조실험 뒤 사진, 및 수분 공급 후 2일 후 사진 143
그림 43. AkNAC19 과발현 식물체의 건조실험 후 기공 개폐 관찰 A, 건조실험 전, 후 기공 개폐 양상. B, 건조실험 전, 후 기공 폭 그래프 144
그림 44. AkNAC19 과발현 식물체의 잎 수분 손실율 측정 A, 시간대별 AkNAC19 과발현 식물체의 잎. B, 시간대별 AkNAC19 과발현 식물체의 잎 수분 손실률 145
그림 45. AkNAC19 과발현 식물체에서 건조 스트레스 관련 유전자의 qRT-PCR 결과 분석. A, DREB2A 유전자의 발현 분석. B, DREB2B 유전자의 발현 분석... 148
그림 46. AkNAC19 과발현 식물체의 ABA 처리후 발아율 사진(2일차) A, 대조군 ½MS 배지에서 발아사진. B, 비교군 0.5 uM ABA 첨가된 ½MS 배지에서 발아사진... 150
그림 47. AkNAC19 과발현 식물체의 ABA 처리 후 발아율 비교 분석(2일차)A, 대조군 ½MS 배지에서 식물체의 발아율. B, 비교군 0.5 uM ABA가 첨가된 ½MS 배지에서... 152
그림 48. 구상나무 AkGCR2 유전자의 비교 및 계통수 분석. A, 염기 및 아미노산 서열. B, 아미노산 서열 비교 분석. C, 계통수 분석 154
그림 49. 구상나무 AkbHLH1 유전자의 비교 및 계통수 분석. A, 염기 및 아미노산 서열. B, 아미노산 서열 비교 분석. C, 계통수 분석 156
그림 50. 구상나무 AkATL78 유전자의 비교 및 계통수 분석. A, 염기 및 아미노산 서열. B, 아미노산 서열 비교 분석. C, 계통수 분석 158
그림 51. 구상나무 AkABI1 유전자의 비교 및 계통수 분석. A, 염기 및 아미노산 서열. B, 아미노산 서열 비교 분석. C, 계통수 분석 160
그림 52. 구상나무 AkABCG21 유전자의 비교 및 계통수 분석. A, 염기 및 아미노산 서열. B, 아미노산 서열 비교 분석. C, 계통수 분석 162
그림 53. 구상나무 AkXERICO 유전자의 비교 및 계통수 분석. A, 염기 및 아미노산 서열. B, 아미노산 서열 비교 분석. C, 계통수 분석 164
그림 54. 한라산 영실 구상나무로부터 추출한 신규 유전자의 분석. A, M; marker. 1; AkGCR2(1,278 bp). 2; AkbHLH1(993 bp). B, 3; AkATL78(606 bp)... 166
그림 55. 신규 유전자의 운반체 제작 과정(6종). A, AkGCR2, 및 AkbHLH1 유전자의 운반체 탑재 방법. B, AkATL78, AkABI1, AkABCG21 및 AkXERICO 유전자의... 167
그림 56. 구상나무 미성숙 배에서 발달된 건강한 배아줄기세포. A, 구상나무 미성숙 배를 ½MS+TDZ 2 mg/L 배지에 치상하여 유도한 배아줄기세포. B, 유도된... 171
그림 57. 고체배지에서 구상나무 배아줄기세포의 관찰 172
그림 58. 액체배지에서 구상나무 배아줄기세포의 관찰 173
그림 59. ½MS 배지에서 구상나무 배아줄기세포의 성장 사진 174
그림 60. 식물생장조절물질 처리 후 재분화 과정의 배아줄기세포사진(12종) 175
그림 61. 식물생장조절물질 처리 후 재분화 과정의 배아줄기세포 사진(2종) 176
그림 62. 배아줄기세포에서 분화 중인 조직. A, 구상나무 배아줄기세포가 ½MS+BA 1 mg/L 배지에서 분화중인 조직. B, 구상나무 배아줄기세포가... 177