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표제지
목차
논문 개요 9
제 1 장 서론 10
제 1 절 연구배경 10
제 2 절 연구목적 14
제 2 장 실험재료 및 방법 15
제 1 절 실험재료 15
1. 실험균주 및 plasmid vector 15
1) Escherichia coli strain 및 plasmid vector 15
2) Listeria genus 18
2. 균주 배양 배지 및 조성 19
1) 액체 배지의 제조 및 조성 19
2) 고형 배지의 제조 및 조성 20
3) 항생제 배지 제조 및 조성 20
3. 재조합 DNA 관련 효소 및 시약 22
4. Oligonucleotide primers 23
1) Listeria multiplex PCR 검출용 primer 23
2) L. monocytogenes의 iap 유전자 증폭을 위한 primer 23
3) Yeast expression vector construction용 primer 23
5. SDS-PAGE 관련 시약 26
제 2 절 실험방법 28
1. Listeria total chromosomal DNA 순수분리 28
2. E.coli에서의 plasmid 순수 분리 29
3. Lis-mix multiplex PCR의 표준균주에서의 최적조건 30
4. L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri의 검출을 위한 Siw-mixIII multiplex PCR 31
5. Gradient PCR을 이용한 L. ivanovii의 최적 검출 조건 검사 32
6. Lis-mix multiplex PCR 반응을 위한 chromosomal DNA isolation method 비교 33
7. 식품에 대한 Lis-mix multiplex PCR 검출법의 효율성 검사 33
8. α-factor, gfp, His-taq 유전자 증폭 34
9. iap/mono 유전자의 증폭 36
10. Restriction Analysis 36
11. DNA의 전기영동 37
12. DNA Elution 38
13. Ligation 40
14. Competent cell제조 및 transformation(E.coli) 40
15. Transformation in Saccharomyces cerevisiae(DY150) 41
16. pYES2-αGH 재조합 DNA의 yeast에서의 발현 42
17. 단백질 농축 43
18. SDS-PAGE 43
1) Gel casting 43
2) Gel staining 및 destaining 45
19. Fluorescent microscope와 Luminescence Spectrometer를 이용한 His-tag/GFP 융합 단백질의 형광 측정 46
제 3 장 결과 및 고찰 47
제 1 절 Lis-mix multiplex PCR detection 47
1. Lis-mix multiplex PCR의 표준균주에서의 최적조건 47
2. Lis-mix multiplex PCR 반응을 위한 chromosomal DNA isolation method 비교 49
3. 식품에 대한 multiplex PCR 검출법의 효율성 검사 51
제 2 절 Siw-mixIII multiplex PCR detection 53
1. Siw-mixIII multiplex PCR for L. ivanovii species 53
2. Gradient PCR을 이용한 L. ivanovii의 최적 검출 조건 54
제 3 절 Development new yeast expression vector for listerial specific antigen 56
1. α-factor, gfp, His-taq 유전자 증폭 56
2. 증폭된 α-GH 유전저의 cloning 58
3. α-GH의 yeast 발현계 vector pYES2로의 vector exchange 60
4. Transformation in Saccharomyces cerevisiae(DY150) 64
5. pYES2-αGH 재조합 DNA의 yeast에서의 발현 66
6. 단백질 농축 66
7. SDS-PAGE 67
8. Fluorescent microscope에 의한 재조합 GFP의 형광 측정 69
9. Fluorescent microscope에 의한 재조합 GFP의 형광 측정 71
10. iap/mono 유전자의 증폭 73
제 4 장 결론 76
참고문헌 78
부 록 87
Abstract 89
감사의 글 90
Table 1. Genotype of Strain 15
Table 2. List of Listeria spp. isolated in foods 19
Table 3. Compositions of culture medium per liter 21
Table 4. Antibiotic solutions 22
Table 5. Sequence of oligonucleotide used Listeira multiplex PCR for detection of Listeria Spp 24
Table 6. Sequence of oligonucleotide for amplification of iap/mono gene 25
Table 7. Sequence of oligonucleotide for construction of yeast expression vector 25
Table 8. Chemical composition related to SDS-PAGE gel 26
Table 9. Chemical compositions of SDS-PAGE buffers 27
Table 10. Chemical composition of TAE buffer 37
Table 11. Reagents for preparing gel for Tris-glycine SDS-PAGE 45
Table 12. Measurement of Fluorescence with GFP 72
Figure 1. Genetic map of pBX 16
Figure 2. Genetic map of pQE-gfp 16
Figure 3. Genetic map of pPICZαA 17
Figure 4. Genetic map of pYES2 18
Figure 5. Identification of Listeria spp. by using Lis-mix multiplex PCR from Listeria standard culture in electrophoresis 1.2% agarose gel was used with 1XTAE buffer 48
Figure 6. Lis-mix multiplex PCR of Listeria spp. with chromosomal DNA that were isolated by different methods 50
Figure 7. A detection of Listeria spp. by Lis-mix multiplex PCR in foods 52
Figure 8. A detection of L. ivanovii by Siw-mixⅢ multiplex PCR 54
Figure 9. Gradient PCR for the detection of L. ivanovii using IVA and LisB primers 55
Figure 10. Diagram of production of α-GH used PCR 56
Figure 11. PCR product of α-factor-gfp-12XHis-tag in electrophoresis used for 1.2% agarose gel, 1X TAE buffer 57
Figure 12. Genetic map of pBX-αGH 59
Figure 13. Restriction of pBX-αGH by HindIII and in XbaI electrophoresis used for 1.2% agarose gel, 1X TAE buffer 60
Figure 14. Genetic map of pYES2-αGH 61
Figure 15. Restriction of pYES2-αGH by HindIII and XbaI in electrophoresis used for 1.2% agarose gel, 1X TAE buffer 63
Figure 16. Schematic presentation of recombinant pYES2-αGH vector construction 64
Figure 17. Transformant of pYES2-αGH in YNB(uracil-) media 65
Figure 18. Expression of pYES2-αGH clone in yeast 68
Figure 19. Microscope images of yeast involved pYES2-αGH clone 70
Figure 20. PCR product of iap/mono in electrophoresis used for 1.2% agarose gel, 1X TAE buffer 74
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