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표제지

목차

국문요지 5

I. 서론 7

II. 실험재료 및 방법 10

1. 톡소포자충 계대 10

2. HeLa세포 배양 10

3. [³H]-uracil incorporation assay 10

4. Counting assay 11

5. 전자현미경 관찰 11

6. 광학현미경 관찰 12

7. 통계처리 12

III. 실험성적 13

1. 세포외 톡소포자충의 배지에서의 증식 억제 13

2. 세포외 톡소포자충의 배양 후 미세구조의 변화 14

3. 배양한 세포외 톡소포자충의 대식세포에 감염 후 증식 15

IV. 고찰 23

V. 결론 30

참고문헌 32

Abstract 34

초록보기

 톡소포자충(Toxoplasma gondii)은 Phylum Apicomplexa에 속하는 세포내 기생하는 원충으로 사람과 동물에서 감염을 일으키며 인체에는 태반을 통한 선천적 감염이나 음식을 통하여 감염이 이루어진다. 임산부에 감염된 경우 사산이나 태아의 기형(뇌수종 등)을 가져오며 장기이식환자에서 면역억제제를 쓰거나 AIDS환자에서 기회감염을 일으킬 수도 있다. 톡소포자충은 빠른분열체(tachyzoite), 느린분열체(bradyzoite, tissue cyst) 그리고 포자소체(sporozoite, oocyst)로 형태가 다양하며 난포낭(oocyst)은 종숙주인 고양이 대변에서 볼 수 있고 tachyzoite나 bradyzoite는 사람을 포함한 중간숙주에서 관찰된다. 톡소포자충은 사람을 포함한 중간숙주에서 stage 전환이 일어나 급성감염에서는 tachyzoite형태로 빠르게 분열하고 만성감염에서는 cyst내 bradyzoite로 느리게 분열하며 주로 뇌나 근조직에 위치한다. 톡소포자충의 cyst는 충주(strain)에 따라 다르나 감염된 숙주조직에서 수개월 또는 일생동안 남아 있을 수 있다. Tachyzoite와 bradyzoite간의 상호 전환은 질병의 유발에 매우 중요한 역할을 한다. 이 실험에서는 톡소포자충(RH) tachyzoite를 세포가 없는 배양액에서 배양하였을 때 톡소포자충의 증식이 일어나는지 또는 tachyzoite내 소기관에 어떤 변화가 나타나는지 그 형태를 투과 전자 현미경(TEM)으로 관찰하였다. 또 세포외 톡소포자충을 숙주세포 없이 일정시간 배양한 후 시험관 내에서 복강세포에 감염시켜 충체의 증식이 일어나는지 알아보았다.

톡소포자충을 숙주세포 없이 배지에서 배양하여 uracil incorporation assay와 counting assay로 충체증식을 알아보았다. 톡소포자충의 uracil uptake는 RPMI 1640/10% FBS(RPMI 1640-S)에서 배양 2시간 후 283.7±119.59 cpm이었고 배양 18시간 후에는 658.3±117.45 cpm이었다. 반면 RPMI 1640-S에 HeLa 세포를 넣고 톡소포자충을 배양한 경우 배양 2시간 후 615.2±246.23 cpm, 배양 18시간 후 7,976.7±4,156.25 cpm이었다. 충체 counting assay에서도 숙주세포 없이 생리식염수에서 18시간 배양한 경우 충체증식이 없거나 감소되었고 RPMI 1640-S에서 18시간 배양한 경우 1.7~2.3배의 충체증식을 관찰하였다. 세포외 톡소포자충을 RPMI 1640-S에서 6시간, 18시간, 30시간, 48시간, 72시간 배양한 후 투과전자현미경으로 충체를 관찰하였다. 배양 6시간부터 48시간까지 톡소포자충 tachyzoite 소기관은 큰 변화가 없었다. 배양 6시간부터 충체 세포질 내에 amylopectin 과립이 나타나 배양 48시간까지 그 양이 점차 증가하였다. 배양 30시간 후 세포질에 탐식한 공포가 나타났고 배양 72시간에는 거의 모든 tachyzoite가 붕괴되어 충체막의 blebbing, 핵의 손상 및 충체 내 소기관들이 형태를 알아 볼 수 없었다. 또 배양 72시간 후 conoid나 충체 바깥 막 등 세포골격에 해당하는 부위는 끝까지 형태를 유지하였다. 세포외 톡소포자충을 배양 48시간 후 시험관 내에서 마우스 복강세포에 감염시켰을 때 감염 6시간 후 숙주세포 내 침입 또는 증식이 관찰되어 톡소포자충은 숙주세포 없이도 배양 48시간까지 감염능이 유지되고 있음을 알 수 있었다.

이상의 결과로 톡소포자충은 숙주세포 없이 배양할 경우 amylopectin의 저장 또는 자가포식(autophagy)현상 등의 생존전략으로 tachyzoite 증식을 감소시킴을 알 수 있었다.

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