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Title Page
Contents
List of abbreviations 9
Abstract 12
Introduction 16
Materials and methods 34
Results 46
1. Effect of dopamine on DNA synthesis 47
2. Effect of galectin-1 67
2-1. Effect of galectin-1 on ES Cell proliferation 67
2-2. Effect of galectin-1 on 2-DG uptake 92
3. Effect of BMP-4 on ES cell proliferation 112
Discussion 135
References 153
국문초록 191
감사의 글 195
Table. 1. Oligonucleotide primers for real-time RT-PCR analysis. 45
Figure 1. Time and dose dependency of dopamine on the level of [³H]-thymidine incorporation. (A) Mouse ES cells were incubated in the presence of 10-6 M dopamine for 0 to 48 hr and pulsed with 1 μCi of [³H]-thymidine for 1 hr prior to...(이미지참조) 48
Figure 2. Involvement of D1 and D2 receptor in dopamine-induced inhibition of [³H]-thymidine incorporation. (A) Mouse ES cells were incubated in the presence of SKF 38393, quinpirole, and dopamine (10-6 M) for 12 hr and pulsed with 1 μCi of...(이미지참조) 50
Figure 3. Effect of dopamine on cAMP formation. Mouse ES cells were preincubated to IBMX (10-4 M) for 30 min in order to prevent the degradation of cAMP into 5'-AMP before exposing them to dopamine and then cAMP assay was...(이미지참조) 53
Figure 4. Effect of dopamine on PKC activation. (A) Mouse ES cells were incubated with 10-6 M dopamine for 1 hr. PKC protein that was present in the cytosolic and membrane fraction was then detected by western blotting, as...(이미지참조) 54
Figure 5. Effect of dopamine on [Ca2+]i. (A) Mouse ES cells were loaded with 2 M flue 3-AM in serum-free medium for 40 min and treated with dopamine (10-6 M). Mouse ES cells were pretreated with (B) SQ 22536 (10-6 M), (C) neomycin (10-4...(이미지참조) 55
Figure 6. Effect of dopamine on the phosphorylation of mitogen-activated Protein kinases (MAPKs). (A) Mouse ES cells were treated with 10-6 M dopamine for 0 to 90 min. The phosphorylated ERX 1/2, p38 MAPKs, and JNK were then detected as...(이미지참조) 57
Figure 7. Effect of dopamine on oxidative stress. (A) Mouse ES cells were incubated with dopamine for 12 hr and then H ₂ O ₂ release was then measured. The values are reported as the mean ± SE of three independent experiments with... 60
Figure 8. Effect of dopamine on cyclin E, CDK-2, cyclin D1, CDK-4, p21cip1, and p27kip1. (A) Mouse ES cells were incubated with SKF38393, quinpirole, or dopamine (10-6 M) for 12 hr. The total protein was extracted and blotted with an...(이미지참조) 63
Figure 9. The hypothesized model for the signal pathways involved in dopamine-induced inhibition of ES cell proliferation. Dopamine activates D1 and D2 receptor, which stimulate either adenylyl cyclase to induce PKA activation or... 65
Figure 10. Effect of galectin-1 on [³H]-thymidine incorporation. Time (A) and dose (B) response of galectin-1 on [³H]-thymidine incorporation. Mouse ES cells were treated with galectin-1 (10 ng/ml) for various times (0 - 24 hr) or with different... 68
Figure 11. Effect of gatectin-1 on cell cycle regulatory protein expression. The time course of cyclin D1, cyclin E, and p27kip1 protein expression was analyzed by Western blot analysis as described in Materials and Methods. The cells were treated...(이미지참조) 71
Figure 12. Involvement of carbohydrate-binding activity of galectin-1 on [³H]-thymidine incorporation. (A) The cells were treated with galectin-1 either in the presence or absence of lactose (10mM) or sucrose (10 mM; used as a... 73
Figure 13. Involvement of Src and caveolin-1 in effect of galectin-1. Mouse ES cells were treated with galectin-1 (10 ng/ml) for various times (0-240 min) and the phosphorylation of Src and caveolin- 1 was detected by Western blot analysis. (B)... 77
Figure 14. Effect of Mβ-CD on caveolin-1 expression in ES cell membrane raft. (A) Lysates of untreated (control) or 10 mM methyl-β-cyclodextrin (Mβ-CD)-treated cells were subjected to discontinuous sucrose density gradient fractionation. Each... 79
Figure 15. Involvement of Src and caveolin-1 in galectin-1-induced cell cycle regulatory protein expression and DNA synthesis. (A) Mouse ES cells were pretreated with PP2 for 30 min prior to galectin-1 (10 ng/ml) treatment for 24 hr,... 80
Figure 16. Involvement of Src, caveolin-1, and ERas in galectin-1-induced Akt phosphorylation. (A) Mouse ES cells were treated with galectin-1 (10 ng/ml) for various times (0 - 240 min), and the phosphorylation of Akt (Ser473, Thr308) was...(이미지참조) 83
Figure 17. Involvement of Src and caveolin-1 in galectin-1-induced mTOR signaling. (A) Mouse ES cells were treated with galectin-1 (10 ng/ml) fir various times (0-240 min), and the phosphorylation of mTOR, p70S6k, and 4E-BP1 was... 86
Figure 18. Involvement of Akt and mTOR in galectin-1-induced cell cycle progression. (A) Mouse ES cells were pretreated with Akt inhibitor (10-5 M) and rapamycin (a mTOR inhibitor, 10-9 M) prior to galectin-1 (10 ng/ml) treatment for...(이미지참조) 89
Figure 19. The hypothetical model of the signaling pathways involved in galectin-1-induced cell proliferation. Galectin-1 activates caveolin-1, which is induced by activated Src. In addition, galectin-1-activated caveolin-1 stimulates Akt to induce... 91
Figure 20. Effect of galectin-1 on 2-deoxyglucose (2-DG) uptake. Time (A) and dose (B) response of galectin-1 on 2-DG uptake. The mouse ES cells were treated with galectin-1 (10 ng/ml) for various times (0 - 24 hr) and with different doses of... 93
Figure 21. Effect of galectin-1 on GLUT-1 mRNA and protein expression. (A) GLUT-1 mRNA expression levels by galectin-1 (10 ng/ml) at various times (0 - 24 hr) were determined by RT-PCR. The bands represent 544 bp GLUT-1, and 350 bp... 95
Figure 22. Involvement of GLUT-1 in galectin-1-induced increase of 2-DG uptake. (A) The mouse ES cells were transfected for 36 hr with either a SMARTpool of GLUT-1 siRNAs (50 nM) or a non-targeting control siRNA (50... 98
Figure 23. Effect of galectin-1 on GLUT-1 transcription and translation. (A) Real-time PCR quantitation of GLUT-1. The mouse ES cells were pretreated with actinomycin D for 30min prior to the galectin-1 treatment. *p< 0.05 vs. Control;... 101
Figure 24. Involvement of Ca2+/protein kinase C (PKC) in galectin-1-induced 2-DG uptake. (A) The cells were treated with galectin-1 for various times (0 - 240min), and the phosphorylation of pan-PKC was detected (upper panel). In addition, PKC...(이미지참조) 103
Figure 25. Involvement of ERX 1/2 in galectin-1-induced 2-DG uptake. (A) The mouse ES cells were treated with galectin-1 (10 ng/ml) for various times (0 - 240min) and the phosphorylation of ERK 1/2 was detected by Western blot... 106
Figure 26. Involvement of P13K/Akt in galectin-1-induced 2-DG uptake. (A) The mouse ES cells were treated with galectin-1 (10 ng/ml) for various times (0 - 240 min) and the phosphorylation of Akt (Ser473, Thr308) was detected by Western blot...(이미지참조) 108
Figure 27. Involvement of mTOR/p70S6K/STAT3 in galectin-1-induced 2-DG uptake. (A) The mouse ES cells were treated with galectin-1 (10 ng/ml) for various times (0 - 240min) and the phosphorylation of mTOR, p70S6k, and STAT3 were... 110
Figure 28. Effects of BMP-4 on the characterization of mouse ES cells. The mouse 25 cells were subcultured up to 5 passages in the presence of BMP-4 (100 ng/ml). The alkaline phosphatase enzyme activity and immunofluorescence staining with... 113
Figure 29. Effects of BMP-4 on [³H]-thymidine incorporation. Time (A) and dose (B) responses of BMP-4 effects on [³H]-thymidine incorporation. Mouse ES cells were treated with different BMP-4 doses (0 - 100 ng/ml) for 24 hr or with BMP-4... 115
Figure 30. Effect of BMP-4 in cell cycle regulatory protein expression. (A) The time course of cyclin D1 and p27kip1 protein expression was analyzed by Western blot analysis as described in the Materials and Methods section. Cells were treated...(이미지참조) 118
Figure 31. Involvement of Smad1 in BMP-4 induced ES cell proliferation. (A) Mouse ES cells were treated with BMP-4 (10 ng/ml) at various time points (0 - 120 min) and Smad1 phosphorylation was detected by Western blot analysis. (B) The... 121
Figure 32. Involvement of Wnt1 in BMP-4 induced ES cell proliferation. (A-C) Mouse ES cells were treated with BMP-4 at various time points (0 - 24 hr) and Wnt1 protein was detected by RT-PCR, Western blot analysis, and... 123
Figure 33. Activation of β-catenin by BMP-4. (A) The mouse ES cells were treated with BMP-4 for various time points (0 - 24 hr) and nuclear β-catenin expression was detected by Western blot analysis. (B, C) The mouse ES cells were incubated... 126
Figure 34. Involvement of P13K/Akt in BMP-4-induced cell proliferation. (A) Mouse ES cells were treated with BMP-4 (10 ng/ml) at various time points (0 - 240 min) and Akt308 and Akt473 phosphorylation was detected by Western blot analysis....(이미지참조) 129
Figure 35. Roles of Smad, Wnt, and P13K in ES cell proliferation and undifferentiation. (A) Mouse 35 cells were transfected for 48 hr with either a SMARTpool of Smad4 siRNA, Pl3K siRNA, Wntl siRNA, or non-targeting... 132
Figure 36. The hypothesized model of for signal pathways involved in BMP-4-induced ES cell proliferation.BMP-4-induced ES cell proliferation. BMP-4 activates Smad1 which induces the expression of Wnt. Wnt subsequently stimulates the activation of β... 134
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배아줄기세포는 자가증식 (self-renewal)과 분화 (differentiation)이라는 독특한 특성을 지닌 세포군이다. 이전의 수많은 연구에 의해 외부인자에 의한 배아줄기 세포의 자가증식능의 유지가 가능하다는 것이 증명되어져 왔으며, 또한 세포 배양 환경의 조성 변화에 의해 다양한 세포로 분화가 가능하다고 알려져 있다. 이들 연구의 결과는 다양한 신호전달 기전이 배아줄기세포의 기능 조절에 기여하는 것을 의미하며, 이는 다양한 외부 인자에 대한 반응으로 나타나는 것을 의미한다. 그러므로, 이러한 외부 인자의 효과 및 이와 관련된 신호전달 기전을 이해하는 것은 배아 줄기세포의 잠재적인 가능성을 가시화하는데 필수적이라 할 수 있다. dopamine, galectin-1 및 BMP-4는 배 발생기에 배아로부터 나타나 배아의 발생에 영향을 미치는 물질로 알려져 있다. 본 연구는 dopamine, galectin-1 및 BMP-4가 배아줄기세포의 증식에 미치는 영향 및 이와 관련된 신호전달 기전을 규명하기 위해 수행되었다. 결과는 아래와 같다.
1. Dopamine은 농도 및 시간 의존적으로 DNA 합성을 억제하였으며, Dopamine, SKF 38393 (D1 수용체 효현제) 및 quinpirole (D2 수용체 효현제) 또한 [³H]-thymidine incorporation을 억제하였다. 세포내 cAMP는 SKF 38393에 의해서는 증가하였으나, quinpirole은 영향을 미치지 않았다. Protein kinase C (PKC) 단백질은 dopamine에 의해 세포질로부터 세포막으로 이동하였다. Dopamine은 또한 세포내 Ca2+농도를 증가시켰으며, 이는 EGTA (세포 외 Ca2+ chelator), BAPTA-AM (세포 내 Ca2+ chelator), nifedipine (L-형 Ca2+ 통로 억제제), SQ 22536 [adenylyl cyclase (AC) 억제제] 및 neomycin [phospholipase C (PLC) 억제제]에 의해 차단되었다. Dopamine, SKF 38393 및 quinpirole은 extracellular signaling regulated kinase 1/2 (ERK 1/2), p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) 및 stress-activated protein kinase/Jun-N-terminal kinase (SAPK/JNK)의 인산화를 증가시켰다. Dopamine은 또한 세포 내 H₂O₂ 농도를 증가시켰으며, 전사인자인 NF-κB를 활성화하였다. SKF 38393, quinpirole 및 dopamine은 세포 주기 조절 단백질의 발현을 감소시켰으며, 이는 [³H]-thymidine incorporation에서의 결과와 일치하였다. Dopamine에 의해 감소된 cyclin E, cyclin dependent protein kinase-2 (CDK-2) 및 cyclin D1, CDK-4의 발현은 pertussis toxin (G protein 억제제), SQ 22536, neomycin, bisindolylmaleimide I (PKC 억제제), SB 203580 (p38 MAPK 억제제), PD 98059 (ERK1/2 억제제) 및 SP 600125 (SAPK/JNK 억제제)에 의해 그 작용이 차단되었다.
2. Galectin-1은 시간 및 농도 의존적으로 [³H]-thymidine incorporation을 증가시켰으며, galectin-1은 또한 cyclin D1과 cyclin E의 발현을 증가시켰고, p27kip1발현을 감소시켰다. Galectin-1은 Src와 caveolin-1의 인산화를 촉진하였으며, caveolin-1의 인산화는 PP2 (Src 억제제)에 의해 차단되었다. 더욱이, caveolin-1 siRNA와 methyl-β-cyclodextrin (Mβ-CD)는 galectin-1에 의해 촉진된 cyclin D1 및 cyclin E의 발현량 및 [³H]-thymidine incorporation을 감소시켰다. Galectin-1은 또한 Akt 및 mTOR의 인산화를 촉진시켰으며, Akt와 mTOR는 cyclin의 발현에 관여하는 것을 알 수 있었다. Galectin-1에 의한 Akt와 mTOR 의 인산화는 PP2, caveolin-1 siRNA 및 Mβ-CD에 의해 억제되었다. Galectin-1에 의한 mTOR의 인산화는 LY 294002 (PI3K 억제제) 및 Akt inhibitor에 의해 유의적으로 억제되었다. Galectin-1에 의한 cyclin D1 및 cyclin E의 발현증가와 p27kip1의 발현 감소는 Akt inhibitor 및 rapamycin (mTOR 억제제)에 의해 억제되었으며, 이는 유세포분석 (flow-cytometry)에 의해서도 일치하는 결과를 나타내었다. Galectin-1은 또한 2-deoxyglucose (DG) uptake를 시간 및 농도 의존적으로 증가시켰다. Galectin-1에 의해 증가된 2-DG uptake는 glucose transporter (GLUT)-1 siRNA에 의해 억제되었다. Galectin-1에 의한 GLUT-1 mRNA 및 단백질의 발현 증가는 actinomycin D과 cycloheximide에 의한 단백질의 전사와 번역 억제에 의해 차단되는 것을 관찰하였으며, galectin-1에 의한 2-DG uptake의 증가 또한 actinomycin D 및 cycloheximide에 의해 차단되었다. 이와 관련된 신호전달 기전을 규명하기 위한 실험에서, galectin-1은 세포 내 Ca2+농도 및 PKC의 활성화를 증가시켰으며, PKC는 ERK 1/2 인산화를 유발하는 데 관여하는 것을 알 수 있었다. 반면, galectin-1에 의한 phosphoinositol-3-kinase (PI3K)/Akt의 활성화는 ERK 1/2 신호전달 경로에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었으며, galectin-1에 의한 mammalian target of rapamycin (mTOR)의 활성화는 PI3K/Akt에 의한 것을 알 수 있었다. 또한, galectin-1에 의한 GLUT-1 단백질의 발현 및 2-DG uptake의 증가는 ERK1/2, PI3K/Akt 및 mTOR 신호의 억제에 의해 차단되는 것을 관찰하였다.
3. BMP-4는 시간(≥ 8 hr) 및 농도(≥ 10 ng/ml) 의존적으로 [³H]-thymidine incorporation을 증가시켰다. 또한, BMP-4는 cyclin D1과 p27kip1발현을 시간 의존적으로 증가시켰다. BMP-4에 의해 증가된 [³H]-thymidine incorporation과 cyclin D1 발현은 BMP-4 수용체 길항제인 noggin에 의해 차단되었다. BMP-4는 Wnt1의 발현을 증가시켰다. Wnt1의 발현은 Smad4 siRNA에 의해 감소되었으며, BMP-4에 의해 cyclin D1 발현은 Smad4와 Wnt1 siRNA에 의해 감소되었다. BMP-4는 또한 β-catenin을 활성화하였으며, BMP-4에 의해 활성화된 β-catenin은 Smad4와 Wnt1 siRNA에 의해 차단되었다. BMP-4는 Akt의 인산화를 증가시켰다. BMP-4에 의해 증가된 β-catenin과 cyclin D1의 발현은 PI3K siRNA 및 Akt 억제제에 의해 감소됨을 확인하였다. BMP-4에 의해 증가된 [³H]-thymidine incorporation은 Smad1, Wnt1 및 PI3K siRNA에 의해 유의적으로 감소됨을 관찰하였다. siRNA에 의한 Smad4, Wnt1 및 PI3K 발현의 감소는 배아줄기세포의 미분화 마커인 Oct4, Sox2 및 FoxD3의 발현을 감소시켰다.
결론적으로, 1) dopamine은 cAMP, Ca2+/PKC, MAPKs 및 NF-κB 신호전달 경로를 통해 배아줄기세포의 DNA 합성을 억제하였다. 2) galectin-1은 또한 Src, cav-1 Akt 및 mTOR 신호전달 기전을 통해 배아줄기세포의 증식을 촉진하였으며, Ca2+/PKC/ERK 1/2, PI3K/Akt 및 mTOR 신호전달 경로를 경유하여 포도당의 흡수를 촉진하였다. 3) BMP-4는 Smad, PI3K/Akt 및 Wnt1/β-catenin 의존적인 신호전달 기전에 의해 배아줄기세포의 증식 및 미분화 유지에 기여함을 관찰하였다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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