본문 바로가기 주메뉴 바로가기
22대 대한민국 국회 국회정보길라잡이 국회의원검색
회원가입 로그인
HOME

정보검색

소장정보 검색

국회도서관 홈으로 정보검색 소장정보 검색
결과 내 검색 동의어 포함
결과 내 검색 동의어 포함

-

목차보기

Title Page

Contents

ABSTRACT 8

1. Introduction 11

2. Material and methods 15

2.1. Sampling 15

2.2. Physical characteristics of the soil 15

2.3. Selective isolation 17

2.4. Genomic DNA extraction 18

2.5. PCR amplification and sequencing of 16S rDNA 19

2.6. Phylogenetic analysis 20

2.7. PCR screening of protein coding genes 21

2.7.1. Bacterial strains and culture conditions 21

2.7.2. Selection of gene loci and primers for sequence determination 21

2.8. Antimicrobial activity test 24

2.8.1. Cultivation of isolates 24

2.8.2. Agar diffusion assay 24

2.8.3. PCR-screening of PKS-I, PKS-II and NRPS genes 27

2.9. Characterization of antimicrobial compounds 29

2.9.1. Determination of growth and culture broth pH 29

2.9.2. Effect of pH and heat treatment 29

2.9.3. Solubility of organic solvents 30

3. Results 31

3.1. Physical characteristics of soil samples and selective isolation 31

3.2. Molecular Taxonomy 34

3.2.1. Phylogenetic analysis using 16S rDNA 34

3.3. Comparison of atpD, gyrB and rpoB PCR screening 44

3.4. Antimicrobial activity test 50

3.5. PCR screening of PKS-I, PKS-II and NRPS genes 53

3.6. Characterization of antimicrobial compounds 56

3.6.1. Growth measurement 56

3.6.2. Stability of heat, pH and organic solvents 56

4. Discussion 59

5. References 63

국문초록 66

List of Tables

Table 1. Examples of antibiotics from Streptomyces and Kitasatospora 12

Table 2. Sampling site 16

Table 3. Bacteria strains and nucleotide accession numbers 22

Table 4. Primers for PCR amplification of 3 protein coding genes 23

Table 5. List of microbes for antimicrobial testing 25

Table 6. Primers for PCR amplification of PKS and NRPS genes 28

Table 7. pH of soil samples 32

Table 8. Viable counts of culturable actinobacteria grown on SCA 33

Table 9. BLAST result of isolates 35

Table 10. Tree of sequence similarity 45

Table 11. Results of antimicrobial activity test. 51

Table 12. Results of PCR screening of PKS-I, PKS-II and NRPS genes: Kitasatospora sp. 54

Table 13. Results of PCR screening of PKS-I, PKS-II and NRPS genes: Streptacidiphilus 55

Table 14. Effect of heat, pH and organic solvent treatment on the antimicrobial activity from... 58

List of Figures

Figure 1. Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of Streptomyces. Numbers at... 38

Figure 2. Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of Kitasatospors. Numbers at... 42

Figure 3. Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of Streptacidiphilus. Numbers... 43

Figure 4. AtpD gene tree of Kitasatospora and Streptacidiphilus. Numbers at nodes indicate... 46

Figure 5. GyrB gene tree of Kitasatospora and Streptacidiphilus. Numbers at nodes indicate... 47

Figure 6. RpoB gene tree of Kitasatospora and Streptacidiphilus. Numbers at nodes indicate... 48

Figure 7. 16S rDNA gene tree of Kitasatospora and Streptacidiphilus. Numbers at nodes... 49

Figure 8. Results of agar diffusion assay. Using of paper disc (diameter; 8㎜). 52

Figure 9. Results of growth and pH 57

초록보기

 2008년에 대전 충남대학교의 송림 토양과 공주, 금산, 대천에서 석탄 토양을 채취하였다. 채취한 토양의 pH 범위는 4.6-7.6으로 나타났으며 대부분의 토양이 산성 pH을 나타내고 있음을 확인하였다. 채취한 토양으로부터 방선균 선택배지인 SCA 배지를 이용하여 방선균을 분리하고 16S rDNA을 기반으로 계통학적 분석을 한 결과 95개의 Streptomyces 균주가 33개의 군집, 25개의 Kitasatospora 균주가 8개의 군집, 11개의 Streptacidiphilus 균주가 7개의 군집을 형성하고 있음으로써 토양내에 호산성 방선균이 다수 분포하고 있음을 확인하였으며 9개의 신종 후보군을 확보하였다. 생리활성 생산 특징상 Streptomyces 보다 Kitasatospora와 Streptacidiphilus의 연구가치가 더 높다고 판단하여 두 속을 집중하여 실험을 진행하였다. 16S rDNA 뿐만 아니라 atpD, rpoB, gyrB 유전자를 이용하여 분리 균주들의 종간의 이질성을 더욱 명확히 구분하였다. 3개의 단백질 유전자 분석 결과 두 속이 모두 명확히 구분되는 것을 확인하였고 염기서열 유사도 분석 결과 16S rDNA 염기서열 유사도가 100%도 일치할 지라도 단백질 유전자 염기서열 유사도에서 차이가 있는 것으로 보아 16S rDNA가 동일할지라도 서로 다른 균주임을 나타낸다고 생각할 수 있으며 하나의 유전자보다 여러 유전자를 이용하는 것이 종간의 구분에 있어서 더 많은 정보를 제공한다.

36개의 Kitasatospora, Streptacidiphilus 균주들을 대상으로 PKS, NRPS 유전자의 존재유무를 PCR 기법을 이용하여 선별하였다. Kitasatospora 균주 MMS411-41를 제외하고는 모든 균주가 하나 이상의 유전자를 갖고 있었다. 또한 17개의 prokaryotic pathogen과 16개의 eukaryotic pathogen, disc diffusion 방법을 이용하여 생리활성 측정 실험을 수행하였다. 그 결과 6개의 Kitasatospora 균주가 eukaryotic pathogen에게만 활성을 보였다. 특히, Kitasatospora MMS409-35 균주가 가장 큰 활성을 보였으며 유일하게 곰팡이 병원균에서 활성을 나타내는 특징을 보였다. 그럼으로 MMS409-35 균주가 생산하는 생리활성 물질의 특징을 확립하기 위한 실험을 수행하였다. 그게 앞서 이 균주의 생장 측정을 수행하였는데, 그 이유는 방선균들의 생리활성 생산시기가 생장시기 중 stationary phase에 물질을 만들어 낸다고 보고되어 있기 때문이다. 생장 측정 결과 이 균주는 3일부터 6일까지가 exponential 시기로 보이며 7일 이후부터는 stationary 시기가 시작되었다. 생리활성 능력 실험을 수행할 때 7일 까지 배양 했던 그 시기가 적절한 배양 기간이라고 판단된다. 또한 MMS409-35 균주가 생산하는 생리활성 물질은 열에 강하며 산성에서 염기성 조건에서도 그 활성이 유지되었다. 유기용매를 이용한 추출 결과 오직 부탄올 층에서 활성을 보였다. 이로써 분리된 Streptacidiphilus 균주는 생리활성 능력이 없는 것으로 보아 이전에 보고된 결과와 일치함을 보였지만 계통학적 유연관계로 봤을 때 Kitasatospora와 가까운 유연관계에 있기 때문에 Streptacidiphilus 역시 원핵생물이 아닌 진핵생물에 활성이 있는 물질을 생산할 것으로 생각된다. PCR 결과와 disc diffusion assay 결과를 통합하여 생각해보면 PKS와 NRPS의 존재는 생리활성을 갖고 있는 균주들의 그 생산능력을 뒷받침하기에 충분하다. MMS409-35 균주가 만들어내는 물질이 열과 pH에 안정한 것으로 보아 산업적으로 이용하기에 적절한 물질이 될 것이라고 생각되며 부탄올에서 추출되는 것으로 보아 hydrophilic한 물질일 것이라고 판단되어 진다.

결론적으로, 이 연구를 통해 환경내에 다수의 호산성 방선균의 존재를 확인하였고 16S rDNA룰 비롯한 단백질 유전자 분석 결과 하나의 유전자보다 여러 유전자를 이용하는 것이 더 명확하게 종과 속의 관계를 볼 수 있었으며 16S rDNA 염기서열 유사도가 100% 같다고 해도 단백질 유전자 염기서열 유사도에서는 차이가 있었으며 또한 그 중에서도 생리활성 능력면에서도 차이가 있었다. 또한, 기존에 보고되었던 Kitasatospora와 Streptacidiphilus의 생리활성 스펙트럼을 확인하였고 활성을 보인 균주들은 PKS와 NRPS의 존재를 확인함으로써 그 능력을 뒷받침하기에 충분하다. Kitasatospora 균주가 생산해 내는 물질의 특징상 그 물질이 산업적으로 적용하기 적절한 물질이라고 생각된다.

추천서가 (다양한 추천 자료를 만나보세요)

권호기사보기

권호기사 목록 테이블로 기사명, 저자명, 페이지, 원문, 기사목차 순으로 되어있습니다.
기사명 저자명 페이지 원문 기사목차