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Title Page

Contents

Abbreviations 6

1. Abstract 7

2. Introduction 9

3. Materials and Methods 14

3-1. Plant materials 14

3-2. Genomic DNA isolation 14

3-3. Analysis of RAPD 16

3-4. Gene cloning 16

3-5. Development of SCAR markers 17

3-6. Scoring and data analysis 20

3-7. Protein extraction 20

3-8. 2-DE analysis 21

3-9. In-gel digestion 21

3-10. MALDI-TOFTOF MS 22

3-11. Amino acid analysis 23

3-12. Total protein content analysis 23

3-13. HPLC-DAD-ESI/MS analysis 24

4. Results and Discussion 25

4-1. RAPD pattern of Korean sweet potato cultivars 25

4-2. Genetic relationship between 28 sweet potato cultivars 25

4-3. Identification of biomarker using SCAR primers 30

4-4. Measurement of free amino acids and total protein contents 33

4-5. Two-DGE analysis of 6 sweet potatoes leaves and protein identification 37

4-6. Quantitative measurement of caffeoylquinic acid family 43

5. References 47

요약 57

List of Tables

Table 1. The list of sweet potato cultivars used for this experiment. 15

Table 2. Nucleotide sequences of 100 random primer used in RAPD analysis. 18

Table 3. Analysis for DNA polymorphisms generated by 75 RAPD primers in 28 sweet potato cultivars 28

Table 4. Analysis of free amino acid contents (%) in 6 sweet potato cultivars. 36

Table 5. Proteins were identified by MALDI-TOF TOF MS. 42

List of Figures

Figure 1. Overview for the procedure to develop biomarkers of sweet potato cultivars. Three approaches were employed in this study; One is genomics... 13

Figure 2. RAPD patterns from each of 28 sweet potato cultivars using primer AA08. Seventy five random 10-mer primers were used to assay polymorphisms... 27

Figure 3. Dendrogram of 28 sweet potato cultivars generated by UPGMA cluster analysis. 31

Figure 4. SCAR marker converted from RAPD marker indicated by arrow. Fragments generated by amplification were separated according to size on 1.5%... 32

Figure 5. Photographs of sweet potato leaves used for proteomics and metabolomics analysis. Sweet potatoes were selected according to their flesh... 34

Figure 6. Total protein content of leaves of 6 sweet potato cultivars selected their flesh color traits (cream color, orange color, purple color). Protein content was... 35

Figure 7. 2-DGE analysis of total protein extracts of leaves (500 ㎍) from 6 sweet potatoes. Total protein was extracted with Mg/NP-40 buffer and... 39

Figure 8. Total number of significant cultivar specific spots in 6 sweet potatoes. 40

Figure 9. Representative protein spots in 6 sweet potatoes. High magnification views of cultivar specific spots showing significant differences are shown. Data... 41

Figure 10. HPLC chromatograms for differential phytochemical profiles of 6 sweet potato cultivars. Phytochemical analysis was performed by reverse-HPLC.... 44

Figure 11. MS spectras of caffeoylquinic acid. Peak 1: 3-O-caffeoylquinic acid (191.01); Peak 2: 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (515.3); Peak 3: 3,5-di-O-... 45

Figure 12. Chemical structures of compounds in sweet potato leaves identified by HPLC-MS analysis. 46

초록보기

 현재 고구마의 재배 시 단일 품종화가 이루어지지 않고 있으며 혼재되어 존재하여 상품의 단일화나 규격화가 힘들어, 고구마의 산업적 이용도 증대 및 새로운 시장개척 등을 위한 고구마 품종 판별 마커의 개발이 필요하다. 따라서 한국에서 육성된 고구마 28개 품종판별을 위한 DNA 및 단백질 마커를 개발하기 위해 유전체, 단백질체, 대사체 분석을 이용하여 실험을 실시하였다.

고구마 품종 특이적 마커 개발을 위한 유전체 분석은 RAPD (random amplified polymorphic DNA) 를 수행하였다. 100개의 random primer 중 밴드가 분명하고 다형성 (polymorphism)이 높은 75개의 primer를 선발하여 분석한 결과 총 706개의 증폭된 밴드를 얻었는데 각 primer에 의해 증폭된 밴드의 수는 1~18개로 다양하게 나타났으며 primer 한 개당 평균 9.4개의 DNA밴드가 증폭되었다. 총 706 개의 밴드 중 다형성을 보이는 밴드의 수는 605개(82.5%)로 매우 높은 다형성을 나타내었다.

DICE 유사계수에 기초한 비가중평균결합법(UPGMA)의 집괴 분석 결과 'Dice'유사도 값의 전체 범위는 0.6876~0.9237 였으며, 평균 유사도의 값은 0.8057 였다. 품종간 가장 높은 유사도 값(0.9237)을 나타낸 것은 신율미와 중미였고, 가장 낮은 유사도 값 (0.6876)을 나타낸 것은 화이트스타였다. 전체 고구마는 하얀색, 담황색, 보라색 등 3개의 cluster로 분리되는 경향이 있었다. RAPD 결과, 36개의 품종 특이 RAPD 밴드가 증폭되었고, 이들 밴드는 RAPD 밴드의 단점을 보완하고자, SCAR 마커로 전환되었다. 하지만, SCAR primer 검정결과, 다른 공시 품종에서 동일한 크기의 band가 나타나 SCAR marker로써 활용이 어려웠다. 이러한 결과는 고구마의 높은 게놈 사이즈 때문에 품종 특이적인 DNA fragment가 다른 품종에서도 존재하는 반복염기서열일 가능성이 큰 것으로 생각되며, 그 결과 각 품종에 특이적인 품종 판별 마커가 생성될 것으로 예상했던 것과는 다르게 다른 품종에서도 DNA 단편이 생성된 것으로 추정된다. 결과적으로 한 쌍의 SCAR primer가 650bp에서 하얀미에 특이적인 band를 나타내어, 하얀미 품종의 SCAR 마커로써 활용이 가능하였다. 이와 같은 결과는 낮은 확률이지만 높은 배수체를 가진 작물에서도 유전자 마커가 가능하다는 것을 시사한다.

Dendrogram 결과를 바탕으로 고구마의 육질의 색에 따른 특징에 맞는 고구마를 선택하였다. 주황색 고구마는 주황미, 신황미를 이용하였으며, 보라색 고구마는 자미, 신자미, 담황색 고구마는 율미, 신건미를 이용하였다. 선택 된 고구마는 차이를 확인하기 위해 총 단백질 함량과 유리아미노산 조성을 분석하였다. 그 결과, 보라색 고구마인 신자미에서 단백질 함량이 가장 높게 나타났으며, 유리 아미노산 함량 또한 보라색 고구마에서 높게 나타나는 경향이 있었다. 이를 토대로 품종 간 단백질에도 차이가 있을 것으로 보고, 품종 특이적 단백질 마커를 개발하기 위한 2-DGE 분석을 시행하였다. 분석에 이용된 고구마의 단백질은 각 품종의 어린 잎에서 추출되었다. 각각의 단백질은 2-DGE (pH4-7)에서 분리되었고, CBB로 염색하였다. 그 결과 평균 500개의 단백질을 분리하였고, 그 중 신자미 4개, 신황미 7개, 신건미 3개, 자미 4개, 율미 8개, 주황미 6개 등 총 32개의 품종 특이적으로 발현하는 단백질을 확인하였다. 확인 된 spot은 MALDI-TOFTOF MS로 분석하였고, 그 중 9개의 spot이 동정되었다. 그 결과, Spot 1-4는 probable protein transport Sec1b, spot 2-1은 putative protein ycf1, spot 2-5는 Ribulose bisphosphate carboxylase large chain (Fragment), 3-1은 ATP-dependent zinc metalloprotease FtsH3, spot 4-1은 Phosphoribulokinase, spot 4-2는 chaperone protein ClpC1, spot 5-4, 5-5, 5-6은 Ribulose bisphosphate carboxylase large chain으로 동정되었다.

품종 판별 기준의 하나로 고구마 품종 간 2차 대사산물에도 차이가 있을 것이라고 예상하여, 유연관계 분석을 통해 선발된 6개의 고구마에 대한 폴리페놀 화합물을 분석하였다. 그 결과, 모든 품종에서 주요한 4개의 peak가 검출되었고, LC-MS로 분석한 결과, caffeoylquinic acid family임을 확인하였다. 고구마 잎 추출물에서 검출된 폴리페놀 물질은 주황색 고구마인 주황미에서 가장 높게 나타났으며, 그 다음은 율미, 신자미, 신건미, 신황미, 자미 순으로 나타났다. 2차 대사산물 분석 결과, 유연관계 분석과는 다른 품종 간 차이는 있었지만, 육색에 따른 차이는 보이지 않았다.

이러한 연구 결과는 그 동안 높은 배수체 때문에 유전자 수준에서 품종 판별을 하기 힘들었던 고구마를 단백질 수준에서 품종 판별을 할 수 있다는 가능성을 제시한다. 향후 좀 더 많은 공시품종을 대상으로 2-DGE를 이용한 단백질 분석을 시행한다면, 국내 모든 품종에 대한 품종 판별 마커로써 활용될 수 있다고 예상된다.

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