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Contents

ABSTRACT 9

1. INTRODUCTION 12

1.1. Hepatitis C 12

1.2. Hepatitis C treatment 13

1.3. RNA interference (RNAi) 14

1.4. siRNA therapy 17

1.5. The scope of thesis 20

2. MATERIALS AND METHODS 21

2.1. Synthesis of epoxide-polyamine conjugates 21

2.2. siRNA design 22

2.3. Characterization of epoxide-conjugates/siRNA nanoparticle 22

2.4. In vitro siRNA transfection study 24

2.5. Intracellular siRNA uptake 25

2.6. In vitro target silencing (PRK2) in human hepatic cells 25

2.7. Preparation of in vivo siRNA formulation 26

2.8. Live animal imaging study 27

2.9. In vivo target silencing in mouse liver 27

2.10. Statistical analysis 28

3. RESULTS AND DISCUSSION 29

3.1. Synthesis of epoxide-polyamine conjugates 29

3.2. Transfection efficiency and cytotoxicity of epoxide-polyamine conjugates in siRNA delivery 34

3.3. Nanoparticle complexation of epoxide-spermine conjugate (C12-SPM) and siRNA 37

3.4. The mechanism of C12-SPM-mediated cellular siRNA delivery 40

3.5. C12-SPM-mediated siRNA delivery for potential suppression of hepatitis C viral replication in vitro 42

3.6. In vivo characterization and biodistribution of administered C12-SPM/siRNA complexes 45

3.7. C12-SPM-mediated in vivo siRNA delivery to the mouse liver 50

4. CONCLUSIONS 55

5. REFERENCES 57

ABSTRACT IN KOREAN 62

List of Tables

Table 1. Current clinical trials for siRNA therapeutics. 18

Table 2. Delivery methods for RNAi-based therapeutics. 19

Table 3. siRNA sequences. 23

Table 4. In vivo toxicity of C12-SPM formulation. 51

List of Figures

Figure 1. The mechanism of RNAi in mammalian cells. 16

Figure 2. Chemical synthesis of epoxide-polyamine-conjugated nanoparticles. 30

Figure 3. The structure of a selected epoxide-polyamine conjugate, C12-SPM. 31

Figure 4. NMR data of C12-SPM. 32

Figure 5. Mass spectrometry data of C12-SPM. 33

Figure 6. In vitro study for evaluation of target silencing efficiency. 35

Figure 7. The cell viability of siRNA transfected Huh-7. 36

Figure 8. Gel retardation assay. 38

Figure 9. In vitro uptake of Cy3-conjugated siRNA delivery using C12-SPM. 39

Figure 10. C12-SPM/siRNA particles elicit cellular uptake by macropinocytosis. 41

Figure 11. In vitro PRK2 silencing efficiency in Huh-7. 43

Figure 12. In vitro PRK2 silencing efficiency in HCV subgenomic replicon cells (R-1 cells). 44

Figure 13. Characterization of in vivo C12-SPM formulation. 47

Figure 14. The particle size of C12-SPM liposomes in phosphate buffered saline (PBS). 48

Figure 15. In vivo distribution of C12-SPM siRNA. 49

Figure 16. In vivo ApoB silencing efficiency in mouse liver. 52

Figure 17. In vivo PRK2 silencing efficiency in mouse liver. 53

Figure 18. In vivo PRK2 silencing efficiency in mouse perfused hepatocyte. 54

초록보기

RNA 간섭현상은 특정 유전자의 발현 억제를 통해 난치성 질병 치료를 위한 도구로 이용될 수 있다. 특히 바이러스에 의해 유도되는 질병 치료를 위한 도구로서 RNA 간섭현상은 무한한 가능성을 갖는다. 그러나 소간섭 RNA를 유전자 치료제로 사용하기 위해서는 높은 전달 효율을 갖는 생체적합성 핵산 전달체의 개발이 우선시된다. 따라서 본 연구에서는 간 조직으로의 소간섭 RNA 전달이 용이한 에폭사이드-폴리아민 나노입자 기반의 소간섭 RNA 전달체를 개발하였다. 이 전달체는 에폭사이드의 개환반응을 통해 쉽고 빠르게 합성되며, 인간 간세포주에서 높은 타겟 유전자 발현 억제 효율을 보인다. 또한 C형 간염 소유전자를 발현하도록 유전자 조작된 인간 간세포주에서 에폭사이드 기반 전달체에 의해 유도된 C형 간염 유전자의 복제를 돕는 숙주 효소의 억제를 통해 C형 간염 유전자 발현이 감소됨을 보았다. 이는 에폭사이드 기반 유전자 전달체에 의한 소간섭 유전자의 전달이 C형 간염 치료제로서의 가능성을 가짐을 입증한다. C형 간염 치료제로서의 가능성이 입증 된 에폭사이드 기반 전달체는 혈액 내에서의 안정성을 향상시키기 위해 리포좀 형태의 제형을 개발하였다. 이 제형은 리포좀 내부로의 소간섭 RNA 봉입이 가능하며, 혈청 검사를 통해 동물 모델에 독성을 보이지 않음을 확인하였으며, 정상 쥐의 간조직 및 간세포에서 높은 타겟 유전자 발현 억제 효율을 보인다. 본 연구는 에폭사이드 기반 유전자 전달체를 통해 간 조직으로 소간섭 RNA를 전달함을 통해 C형 간염 치료제로서의 이용 가능성을 보고자 하였다.

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