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Title Page

BIOGRAPHICAL SKETCH

Contents

CHAPTER I. Enhanced Hippocampal Neurogenesis and Spatial Memory in the Neuron Specific β-pix Isoform Deficient Mice 14

ABSTRACT 15

INTRODUCTION 17

MATERIALS AND METHODS 20

Materials 20

Animal and Genotyping 20

BrdU injection 21

Preparation of Brain Sections 21

Histological Analysis 22

Immunohistochemistry 22

Cell Culture 23

Isolation of Total Protein and Western Blot Analysis 23

Morris Water Maze Task 24

RESULTS 26

Identification of signaling cascade in the neuron specific β-pix knock-out mice. 26

Increased adult neurogenesis in the dentate gyrus of neuron specific β-pix knock-out mice. 27

Enhanced spatial memory formation in neuron specific β-pix knock-out mice. 28

Increased level of β-pix-a in the forebrain of neuron specific β-pix knock-out mice. 29

Activation of cell proliferative signaling proteins by β-pix-a. 30

Unchanged level of cell proliferation Signaling Proteins in the E17.5 brain of neuron specific β-pix knock-out mice. 31

Unchanged cell proliferation in the E17.5 brain of neuron specific β-pix knock-out mice. 32

DISCUSSION 50

CHAPTER II. Localized Overmigration of Neurons by Overexpression of β-pix-d in the Ventricular Zones of Mouse Embryonic Telencephalon 55

ABSTRACT 56

INTRODUCTION 58

MATERIALS AND METHODS 61

Animal 61

Cell Culture 61

Constructs 62

In Utero Electroporation 62

Histological Analysis 63

Immunohistochemistry 63

Immunocytochemistry 64

Isolation of Total Protein and Western Blot Analysis 64

Primary Cortical Neuron Culture 65

In vivo GST Pull-Down Assay 66

Wound Healing Assay (Cell Migration Assay) 66

RESULTS 68

The gain of β-pix-d gene results in disorganization of the neocortex in neuron specific β-pix knock-out mice. 68

Cortical layers are severely abnormal in the β-pix-d-transfected neocortex of neuron specific β-pix knock-out mice. 69

The overexpression of β-pix-d results in overmigration of the neocortex in the normal mice. 70

Cortical layers V-VI are defective in the β-pix-d-overexpressing neocortex of normal mice. 71

The overexpression of β-pix-d induces overmigration of neurons in the neocortex of normal mice at P0. 72

Cortical lamination is defective in the β-pix-d overexpressed neocortex of normal mice at P0. 73

Overexpression of β-pix-d induces neurite outgrowth in various cells. 74

Overexpression of β-pix-d induces neurite outgrowth in cortical neurons. 75

β-pix-d stimulates Rac1 activity. 77

β-pix-d induces cell migration activity in TR cells. 77

DISCUSSION 111

REFERENCES 117

GENERAL ABSTRACT 129

ABSTRACT IN KOREAN 132

List of Figures

Figure 1-1. Activation of hippocampal signaling proteins by the loss of neuron specific β-pix gene function. 34

Figure 1-2. Involvement of neuronal proliferation signaling molecules in the hippocampus of neuron specific β-pix knock-out mice. 35

Figure 1-3. Anatomical differences between neuron specific β-pix knock-out mice and wild type mice. 37

Figure 1-4. Increased adult neurogenesis in the dentate gyrus of neuron specific β-pix knock-out mice. 39

Figure 1-5. New born cells differenciated into neurons in the dentate gyrus of hippocampus. 40

Figure 1-6. Enhanced spatial memory formation in neuron specific β-pix knock-out mice. 41

Figure 1-7. Increased level of β-pix-a in the forebrain of neuron specific β-pix knock-out mice. 42

Figure 1-8. Activation of cell proliferative signaling proteins by β-pix-a. 44

Figure 1-9. Increased level of β-pix-a in the embryonic brain of neuron specific β-pix knock-out mice. 45

Figure 1-10. Unchanged level of cell proliferation Signaling Proteins in the E17.5 brain of neuron specific β-pix knock-out mice. 47

Figure 1-11. Unchanged cell proliferation in the E17.5 brain of neuron specific β-pix knock-out mice. 49

Figure 2-1. Validation of the vector containing the β-pix-d gene. 80

Figure 2-2. Overexpression of β-pix-d results in disorganization of the neocortex in neuron specific β-pix knock-out mice. 82

Figure 2-3. Overexpression of β-pix-d results in disorganization of the neocortex in neuron specific β-pix knock-out mice. 84

Figure 2-4. Cortical organization is severely abnormal in the β-pix-d overexpressing cerebral cortex of neuron specific β-pix knock-out mice. 86

Figure 2-5. Overexpression of β-pix-d results in overmigration of the neocortex in the normal mice. 88

Figure 2-6. Overexpression of β-pix-d results in overmigration of the neocortical neurons in normal mice. 90

Figure 2-7. Cortical layer V-VI is defective in the β-pix-d overexpressed neocortex of normal mice. 92

Figure 2-8. Overexpression of β-pix-d induces overmigration of neurons in the neocortex of normal mice at P0. 94

Figure 2-9. At P0, overexpression of β-pix-d results in overmigration of neocortical neurons in normal mice. 96

Figure 2-10. Cortical lamination is defective in the β-pix-d overexpressed neocortex of normal mice at P0. 98

Figure 2-11. Overexpression of β-pix-d induces neurite outgrowth in neocortical neuroblast, TR cells. 100

Figure 2-12. Overexpression of β-pix-d induces neurite outgrowth in embryonic carcinoma, P19 cells. 102

Figure 2-13. Overexpression of β-pix-d induces neurite outgrowth in cortical neurons at DIV2. 104

Figure 2-14. Overexpression of β-pix-d induces neurite outgrowth in cortical neurons at DIV5. 106

Figure 2-15. β-pix-d stimulates Rac1 activity. 108

Figure 2-16. β-pix-d induces cell migration activity in TR cells. 109

Figure 2-17. A proposed model for the type2 lissencephaly in β-pix-d-overexpressing cerebral cortex. 110

초록보기

 베타픽스는 Rho GTPases의 구아닌 뉴클레오티드 교환인자로서 Dbl homology 와 PH domain을 가지고 있다. 또한 베타픽스는 SH3 domain을 통해 PAK 과도 상호작용을 한다. 베타픽스와 PAK은 세포분열과 세포골격의 재배열에 관여한다. 베타픽스는 베타픽스-a, b, c, d, dL과 같은 isoform이 존재한다. Splice 차이에 따른 구조차이와 분포의 차이는 각기 다른 기능이 있음을 추정하게 한다. 신경발생에서의 베타픽스의 관여는 약간 알려져 있으나, 성체신경발생에서의 분자적 기전은 전혀 알려져 있지 않다.

그래서 우리는 성체신경발생에서의 베타픽스 유전자의 역할을 규명하였다. 이를 위해 신경세포 특이적인 베타픽스가 결여된 마우스의 뇌조직을 분리하여 실험에 이용하였다. 우리는 신경세포 특이적인 베타픽스가 결여된 마우스의 대뇌피질과 해마에서 베타픽스 isoform의 결여를 확인하였다. 놀랍게도, 신경세포 특이적인 베타픽스가 결여된 마우스의 뇌조직에서 베타픽스-a 단백질의 과발현을 관찰할 수 있었다. 우리가 신경세포 특이적인 베타픽스가 결여된 마우스 뇌조직에서 여러가지 MAP kinase와 전사조절인자의 활성도를 측정해 보았을 때, 해마에서 P38, JNK MAP kinase와 CREB, Foxo3a 와 같은 전사조절인자의 활성이 증가된 것을 관찰하였다. 게다가, 신경세포 특이적인 베타픽스가 결여된 마우스의 해마 부위에서 신경세포의 분열의 증가도 관찰되었다. 마지막으로, 우리는 신경세포 특이적인 베타픽스가 결여된 마우스 해마에서의 성체신경발생 증가의 효과를 규명하기 위하여 모리스 수중미로테스트를 실시해 보았을 때 신경세포 특이적인 베타픽스가 결여된 마우스가 정상 마우스에 비해 더 빨리 목적지를 찾는 것을 확인할 수 있었다. 이 연구는 베타픽스에 의한 성체신경발생과 해마기능에 대한 분자적 기전을 이해하는 데 도움을 줄 것이라 사료된다.

세포의 이동은 신경계 발생에 있어 매우 중요한 역할을 한다. Rac1과 Cdc42의 구아닌 뉴클레오티드 교환인자인 베타픽스는 세포의 이동과정에서 세포 골격의 재배열과 같은 역할을 한다고 알려져 있다. 베타픽스는 베타픽스-a, b, c, d, dL과 같은 isoform이 존재한다. 베타픽스-a는 모든 세포에 발현한다고 알려져 있고, 베타픽스-b, c, d는 신경세포에 특이적으로 발현한다. 베타픽스-a의 경우는 그 기능이 비교적 잘 알려져 있지만, 베타픽스-d의 기능에 관한 연구는 전무한 실정이다.

그래서 우리는 배아내 유전자주입법을 이용하여 뇌형성이 진행되고 있는 마우스의 대뇌피질 부위에 베타픽스-d 유전자를 과발현시켜 배뇌피질 발생에서의 베타픽스-d 유전자의 역할을 규명하고자 하였다. 마우스 배아기 13.5일에 유전자 주입을 하여 배아기 15.5일에 그 결과를 관찰해 보았을 때 베타픽스-d의 과발현에 의해 신경세포의 비정상적인 이동을 확인할 수 있었다. 특히 대뇌피질층 5-6번의 층형성 파괴 또한 관찰할 수 있었다. 베타픽스-d가 과발현된 신경세포 중 일부는 대뇌피질의 표면까지 비정상적으로 이동한 것을 관찰할 수 있었다. 게다가, 마우스 배아기 13.5일에 유전자를 주입하고 1주일 후 마우스가 태어난 후 그 결과를 관찰해 보았을 때 베타픽스-d가 과발현된 신경세포 중 일부가 뇌막까지 이동한 것을 관찰할 수 있었다. 그래서 우리는 베타픽스-d의 과발현에 의해 신경세포의 가지들이 더 길게 뻗음으로 인해 세포 이동의 비정상적인 촉진이 나타날 것이라는 가설을 세우게 되었다. 그래서 이를 증명하기 위해 마우스 배아의 대뇌 신경세포에 베타픽스-d 유전자를 과발현시킨 후 그 세포들을 분리하여 신경세포의 가지의 길이를 측정하였다. 정량적인 분석을 통하여 베타픽스-d가 과발현된 신경세포의 가지들이 정상 신경세포에 비해 유의하게 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 이 결과들을 통하여, 신경세포에만 특이적으로 발현하는 베타픽스-d는 신경세포의 가지를 조절하는데 중요한 역할을 할 것이며, 뇌 형성 동안 신경세포의 이동에도 중요한 역할을 할 것이라는 결론을 내릴 수 있었다.

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