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Title Page

BIOGRAPHICAL SKETCH

Contents

INTRODUCTION 14

MATERIALS AND METHODS 19

Animal 19

Cell culture and transient transfection 19

DNA constructs 20

In utero electroporation 21

Immunohistochemistry 21

Histological analysis 22

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 23

Immunocytochemistry (ICC) 24

Transwell migration assay 25

Wound-healing assay 26

Pulldown assay 26

Isolation of total protein and western blot analysis 27

Primary cortical neuron culture 28

RESULTS 29

Spatio-temporal expression of S1P receptor gene families during mouse brain development 29

Over expression of S1P₂ cause abnormal neuronal migration in neocortex 30

Cortical layer is severely abnormal in the S1P₂ over-expressed neocortex 32

Cortical progenitor cells are incorrectly positioned in the S1P₂ over­expressed neocortex 33

S1P₂ increases neuronal differentiation and neuronal polarization 34

Overexpression of S1P₂ induced neurite retraction in cortical neurons 35

The gain of S1P₂ gene results in disorganization of the neocortex neuroblast cell 37

Activation of the Rho-GTP cascade was involved in the S1P₂ -induced neurite retraction 37

Inhibition of ROCK signaling rescues S1P₂ over expressed motility phenotype 38

Rho/Rho-associated protein kinase pathway mediates S1P₂ inhibition of neuroblast cell migration 39

DISCUSSION 91

REFERENCES 96

ABSTRACT 103

ABSTRACT IN KOREAN 105

List of Figures

Figure 1. Expression of SIP₂ receptor gene during mouse brain development. 41

Figure 2. Validation of the vector containing the S1P₂ gene. 42

Figure 3. Temporal analysis of cell migration pattern in S1P₂-overexpressed cerebral cortex. 44

Figure 4. Overexpression of S1P₂ results in disorganization of the neocortex in development mouse brain. 45

Figure 5. Defect in radial migration pattern in S1P₂-overexpressed cerebral cortex. 47

Figure 6. Expression pattern of TBR₁ in S1P₂ over-expressed mouse embryo cortices. 49

Figure 7. Expression pattern of TBR₂ and Reelin in S1P₂ over-expressed mouse embryo cortices. 51

Figure 8. Expression pattern of TBR₂ in S1P₂ over-expressed mouse embryo cortices. 52

Figure 9. Expression pattern of TBR₂ in S1P₂ over-expressed postnatal mouse embryo cortices. 54

Figure 10. Expression pattern of PAX6 in S1P₂ over-expressed mouse embryo cortices. 56

Figure 11. Expression pattern of pHH3 in S1P₂ over-expressed mouse embryo cortices. 58

Figure 12. Expression pattern of Ki67 in S1P₂ over-expressed mouse embryo cortices. 60

Figure 13. Ectopic expression of S1P₂ in neural progenitor cells elevates the abnormal development of mouse cerebral cortex. 62

Figure 14. Expression pattern of TUJ1 in S1P₂ over-expressed mouse embryo cortices. 64

Figure 15. Expression pattern of TUJ1 in S1P₂ over-expressed mouse embryo cortices. 66

Figure 16. Expression pattern of TUJ1 in S1P₂ over-expressed postnatal mouse embryo cortices. 68

Figure 17. Overexpression of S1P₂ induces neurite outgrowth in cortical neuron at DIV2. 70

Figure 18. Overexpression of S1P₂ induces neurite outgrowth in cortical neuron at DIV5. 72

Figure 19. Overexpression of S1P₂ induces neurite outgrowth in cortical neuron at DIV7. 74

Figure 20. Statical analysis of neurite retraction by S1P₂. 75

Figure 21. Temporal analysis of expression pattern in S1P₂-overexpressed neuroblast. 77

Figure 22. S1P₂ stimulates RhoA activity. 79

Figure 23. Involvement of S1P₂ in cell retraction via the Rho GTPase signaling pathway up-stream of ROCK activity. 81

Figure 24. Overexpression of S1P₂ retards neuronal migration. 83

Figure 25. Overexpression of S1P₂ retards neuronal migration. 84

Figure 26. S1P₂ may mediate migration via the Rho GTPase signaling pathway up stream of ROCK activity. 86

Figure 27. S1P₂ may mediate migration via the Rho GTPase signaling pathway up stream of ROCK activity. 88

Figure 28. A proposed model for the periventricular nodular heterotopia in S1P₂-overexpressed cerebral cortex. 90

초록보기

 세포의 이동은 발달하는 뇌에서 매우 중요한 역할을 차지하고 있다. 새롭게 생성된 신경세포들은 그들이 태어난 곳에서부터 최종적으로 위치할 곳까지 긴 거리를 이동하게 되며 그것은 매우 복잡하고 정교하게 이루어져 있다. 세포이동은 다양한 전사인자들과 세포골격 단백질 그 외 세포신호를 조절하는 G 단백질 연결 수용체 (GPCR)를 비롯한 여러 수용체들에 의해서 조절된다. 이러한 조절인자들의 결손이나 과도한 발현은 세포이동에 영향을 미치게 되는데, 특히 뇌 발달 시에는 신경 세포이주장애 (NMDs)를 일으키게 되며 이는 약물 난치성 간질 환자의 원인으로 약 60% 를 차지하고 있다. GPCR 의 리간드 중 하나인 sphingosine-1-phosphate (S1P) 는 수용체를 통해 세포에 신호를 전달하며 세포의 증식, 분화, 이동 등의 세포활성을 조절하고 있다. S1P 수용체중 하나인 S1P₂ 의 역할은 GPCR 연구를 통해 현재까지 잘 연구되어 있지만 S1P₂ 가 뇌 발달 시에 어떤 영향을 미치는지에 대해서는 연구된 바가 없다. 따라서 아직까지 밝혀지지 않은 S1P₂ 의 뇌 발달상의 역할을 밝히기 위하여 본 논문에서는 S1P₂ 과발현 실험을 통해 유전자의 기능을 규명하고자 하였다. 먼저 S1P₂ 의 뇌 발달시의 RNA 발현양상을 알아보고자 RT-PCR 을 시행하였으며, 대뇌피질 발생단계에서 in utero electroporation 기법을 통해 신경세포 이동과정에서 S1P₂ 가 어떤 영향을 주는지 연구하였다. 과 발현된 S1P₂ 는 신경세포의 이동을 강하게 억제하였으며 이는 대뇌피질 기형을 만들어내었다. 형광면역염색법을 이용하여 관찰한 결과, S1P₂ 가 과 발현된 부위에서만 국소적으로 대뇌피질 기형이 일어남을 확인하였으며 이는 신경세포 이동 중 대뇌피질 형성 과정인 radial migration 이 제대로 일어나지 못한 것이 원인이었다는 것을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 현상이 일어나는 이유로는 대뇌피질 발생단계에서 ventricular zone 의 neural progenitor pool 의 비이상적 위치와 그로 인해 생기는 조직의 생성에 기인한다는 것을 확인하였다. 이를 확인하기 위하여 신경모세포에서 실험한 결과 이는 세포뼈대 조절인자인 RhoA 의 과 발현에 의한 것이라는 것을 확인하였으며, 세포에 직접적인 이동에 영향을 주는지 관찰하기 위하여 시행한 transwell migration 에서도 S1P₂ 에 의해 세포의 이동이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 본 연구결과를 통하여 대뇌발생과정에서 S1P₂ 의 과 발현은 사람의 발달 시에 신경세포이주 장애 중 하나인 periventricular nodular heterotopia (PNH) 와 세포학적, 병리적 유사함이 있는 것으로 판단되며, PNH 의 기초의학적 연구를 위한 질환동물모델로서 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

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