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표제지
목차
초록 6
Abstract 8
1. 단일분자분석을 통한 효모 돌연변이 유전체의 분석 10
1.1. Introduction 10
1.2. Material and Method 12
1.2.1. Yeast cell cultivation and irradiation 12
1.2.2. PFGE 13
1.2.3. Optical mapping and Next generation sequencing 14
1.2.4. Conform by PCR 14
1.3. Result and Discussion 16
1.3.1. PFGE for Chromosomal Karyotyping 16
1.3.2. DNA Optical Mapping 17
1.3.3. Conformation by PCR 19
1.4. Conclusion 20
2. 단일분자분석을 이용한 자외선 저항성 대장균의 DNA 손상 분석 21
2.1. Introduction 21
2.2. Material and Method 24
2.2.1. Reactive Oxygen Species Resistance Test 24
2.2.2. Gel Electrophoresis Comet Assay (Traditional method) 25
2.2.3. Surface Cleaning and Derivatization 26
2.2.4. Preparation of Microfluidics Device 27
2.2.5. Single Molecule Analysis 29
2.3. Result and Discussion 32
2.3.1. Resistance Test with Spot Assay 32
2.3.2. Gel electrophoresis 33
2.3.3. Single Molecule Analysis 34
2.3.4. Optical Mapping and Next Generation Sequencing(NGS) Data 35
2.4. Conclusion 38
3. Reference 40
Table 1. Summary of Mutation of CB4000 strains 37
Figure 1. Proton beam irradiation and mutated cell cultivation 13
Figure 2. Yeast chromosome PFGE image 17
Figure 3. Completion of MY33 whole chromosome restriction map 18
Figure 4. Confirmation of chromosome 3 & 6 part shift by PCR 19
Figure 5. Resistance test by spotting assay of MG1655 and CB mutants 24
Figure 6. E. coli cell UV irradiation using Quartz glass 26
Figure 7. Schematic illustration of Microfluidics device 28
Figure 8. Scheme of single molecule analysis for DNA damage detection 31
Figure 9. Reactive Oxgen Species and Ultraviolet Susceptibility for a Reference strain and mutant stains 32
Figure 10. Detection of DNA Damages by Gel Electrophoresis 33
Figure 11. Single molecule analysis for a detection of DNA damages 34
Figure 12. Comparative genomic maps of MG1655 and CB4000 Result 36
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[Part 1] 지금까지 완전한 DNA 염기서열을 해독하기 위해서 수많은 Sequencing 장비들이 개발되어 왔다. 기존 장비들은 한 번의 반응에서 분석할 수 있는 Read length가 30 ~ 1500 bp로 매우 짧다는 한계점이 있다. E. coli DNA 크기가 450만 bp이며 Human genome의 경우 대략 30억 bp 정도이기 때문에, 기존의 sequencing 장비로 분석할 경우 많은 반복작업과 assembly가 필요하며 많은 시간과 비용이 소요된다. 반면 Optical mapping 기술은 Surface 표면에 단일분자 DNA를 길게 펴고 이를 제한 효소로 처리하는 작업을 통하여 DNA를 분석하는 방법으로, 전체 genome을 한번의 반응으로 분석할 수 있다는 장점이 있다. 이는 sequencing에 걸리는 시간과 비용을 단축시키며 다른 sequencing reaction 후 assembly 시에도 유용하게 이용될 수 있다.
이번 연구에서는 Yeast S. Cerevisiae S288c를 Proton beam irradiation으로 돌연변이를 만들고 Pulsed Field Gel Electrophoresis(PFGE)를 이용하여 Chromosome의 구조적 변형을 확인하였다. 또한 이러한 구조적 변형이 어디서 왔는지를 알아보기 위하여 앞서 소개한 Optical Mapping 을 이용하였다.
[Part 2] 자외선은 잘 알려진 돌연변이 생성원인 중 하나이다. 자외선은 이중가닥절단이나 단일가닥절단, 피리미딘 이합체 등의 손상을 입히며, 손상이 너무 많을 경우, 세포가 죽거나 복구과정에서 돌연변이가 발생한다. 그러나 Deinococcus radioduran과 같이 이러한 자외선에 저항성이 있는 박테리아가 존재하며, 잘 알려진 Escherichia coli strain의 하나인 K-12 MG1655로부터 저항성을 갖는 strain이 만들어졌다.
자외선으로 인한 다양한 손상에 대한 대응하기 위한 첫 번째 단계는 DNA손상을 감지하는 것이다. 기존의 DNA 손상 감지 방법은 민감하지 않고 정량적인 분석이 불가능하며, 이중가닥절단만을 감지한다는 한계가 있다. 그러나 우리가 이번 연구에 이용하는 단일분자분석은 이러한 점을 모두 극복할 수 있는 방법으로 Repair Enzyme을 이용하여 다양한 손상을 감지할 수 있으며, 민감하게 정량분석 할 수 있다.
이번 연구에서는 자외선에 저항성을 갖는 대장균의 DNA 서열을 Next Generation Sequencing(NGS)와 Optical Mapping으로 분석하여 저항성의 원인을 알아보고, 단일분자분석을 통해 어떤 손상에 저항성을 갖는지 알아보았다.
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