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Title Page
Contents
ABSTRACT 11
GENERAL OVERVIEW 15
Part 1. Enhanced siRNA Delivery of Ligand-Nona-Arginine 22
Chapter 1. Increased Cytosolic Translocation of siRNA by Cell-Binding Ligands-attached Nona-Arginine 22
1. Introduction 22
2. Materials and Methods 24
3. Results 28
4. Discussion 77
5. Conclusion 82
Part 2. Application of RVG-Nona-(L)-Arginine in Animal Model 83
Chapter 1. Lung Epithelium Targeted IL-4 Receptor α knockdown in Allergic Asthma Model 83
1. Introduction 83
2. Materials and Methods 87
3. Results 93
4. Discussion and conclusion 107
Chapter 2. Macrophage Targeted TNF-α knockdown in Rheumatoid Arthritis Model by intra-articular injection 111
1. Introduction 111
2. Materials and methods 114
3. Results 118
4. Discussion 131
5. Conclusion 133
Reference 134
국문요지 156
GENERAL OVERVIEW 21
Figure 1. Cell-Penetrating Peptide mediated siRNA delivery 21
Part 1-Chapter 1. Increased Cytosolic Translocation of siRNA by Cell-Binding Ligands-attached Nona-Arginine 29
Figure 1. D-R9 and L-R9 peptides are effectively delivered into cells 29
Figure 2. (D/L)-R9 peptides translocate covalently-conjugated recombinant G FP... 30
Figure 3. R9 and RVG-R9 bind siRNA to form nanoplexes 31
Figure 4. D-R9 and L-R9 translocate siRNA in high concentration 32
Figure 5. D-R9 and L-R9 ineffectively translocate siRNA 33
Figure 6. RVG-R9 bind siRNA to form nanoplexes 36
Figure 7. scFvCD7-R9 bind siRNA to form nanoplexes 37
Figure 8. (D/L)-R9 effectively translocate siRNA when attached to a cell-binding... 38
Figure 9. (D/L)-R9 effectively translocate siRNA when attached to a cell-binding... 39
Figure 10. (D/L)-R9 effectively translocate siRNA when attached to a cell-binding... 40
Figure 11. Analysis of cellular entry and trafficking mechanisms of RVG-R9:siRNA 43
Figure 12. Ligand-receptor binding is important for initiating cellular entry 45
Figure 13. Ligand-mediated early cytoplasmic translocation of siRNA is functional 47
Figure 14. RVG-R9:siRNA delivery to the cytoplasm occurs from early endosome 49
Figure 15. Early cytoplasmic entry of RVG-R9:siRNA is actin/dynamin independent 51
Figure 16. Analysis of cellular entry and trafficking mechanisms of RVG-R9:siRNA 52
Figure 17. Inhibition of ligand binding, significantly reduced uptake of RVG-... 55
Figure 18. Ligand-R9 induces localized membrane inversion 56
Figure 19. Annexin V highly localized to the site of RVG-(L)R9:siFITC and vesicle-... 57
Figure 20. Ligand binding induced receptor aggregation 63
Figure 21. RVG-R9:siRNA complexes get endocytosed and traffic within vesicles 65
Figure 22. RVG-(D/L)R9:siRNA extends siRNA release from endosomes, and vesicle... 68
Figure 23. Ligand-(L)R9 enables siRNA release from endosomes prolonging mRNA... 69
Figure 24. Stability of RVG-R9 bound siRNA 71
Figure 25. Endosomal proteolysis is required for siRNA release from late endosomes 73
Figure 26. E-64d treatment selectively and significantly affected mRNA knockdown 74
Figure 27. Scheme illustrating the mechanism of ligand-R9 transloaction 76
Figure 28. Effect of pH in siRNA complexation 81
Part 2-Chapter 1. Lung Epithelium Targeted IL-4 Receptor α knockdown in Allergic Asthma Model 94
Figure 1. Expression of nicotinic acetylcholine receptor in mouse epithelial cell lines 94
Figure 2. Expression of nicotinic acetylcholine receptor in mouse lung tissue 95
Figure 3. RVG-(L)R9:siRNA can deliver siRNA specifically to lung epithelium cell line 97
Figure 4. Intratracheal delivery of RVG-(L)R9:siCy5 to mouse lung tissue 99
Figure 5. RVG-(L)R9:siIL4Rα can induce IL-4R α gene silencing in cell line and... 101
Figure 6. Inflammation response by RVG-(L)R9:siRNA in mice lung tissue 102
Figure 7. OVA-induced Asthma Model 104
Figure 8. RVG-(L)R9:siIL4Rα reduces airway hyper-responsiveness in vivo 105
Figure 9. Histological analysis of reduced mucin expression in goblet cells in vivo 106
Part 2-Chapter 2. Macrophage Targeted TNF-α knockdown in Rheumatoid Arthritis Model by intra-articular injection 119
Figure 1. Delivery and functional effect of RVG-(L)R9:siRNA complex in macrophage... 119
Figure 2. Nicotinic acetylcholine receptor (nAchR) expression on Primary... 121
Figure 3. RVG-(L)R9 can deliver siRNA into CD11b+ Primary macrophage(이미지참조) 122
Figure 4. Schematic diagram of experimental schedule 125
Figure 5. Therapeutic effect of the Intra-articular delivery of RVG-(L)R9 mediated... 126
Figure 6. Analysis of histological examination of arthritic joints within arthritic joints 129
Figure 7. Intra-articular delivery of RVG-(L)R9:siTNF-α reduces TNF-α Production... 130
Movies S1. RVG-(D)R9 mediates cytoplasmic translocation of siRNA 46
Movies S2. RVG-(L)R9 mediates cytoplasmic translocation of siRNA 46
Movies S3. D-R9 does not translocate complexed siRNA 46
Movies S4. L-R9 does not translocate complexed siRNA 46
Movies S5. RVG-(L)R9:siRNA complex induces topical membrane inversion 58
Movies S6. RVG-(L)R9:siRNA complex induces receptor aggregation 66
초록보기 더보기
RNA 간섭 (RNAi) 현상이 발견 된 이후로, 유전자 치료 분야에 이 기술을 기반으로 하는 치료방법을 적용하려는 많은 시도들이 있었다. RNAi는 서열 특이적으로 목표 mRNA를 분해 하여 유전자 억제효과를 보이며, 생물체가 가지는 대부분의 유전자에 적용할 수 있을 것이라고 예상된다. 그러나 치료분야에 적용하기 위해서는 두 가지 큰 장벽이 있다. 첫 번째로는 (-)전하를 띄는 큰 분자인 siRNA를 동일하게 (-)전하를 띄는 세포막을 통과하여 세포 안으로 전달하기 쉽지 않다는 것이다. 두 번째로, 내포 작용을 통해 생성된 엔도좀 안에서 RNA 간섭 현상이 일어나는 세포질로 siRNA를 전달 하는 것이 또 다른 장벽이다. 그러므로 이 두 가지 장벽을 극복하는 것이 RNA 간섭을 이용한 성공적인 치료제 개발에 있어 매우 중요하며, 이를 위해 RNA 간섭 현상이 일어나는 세포질 안으로 siRNA를 효과적으로 전달할 수 있는 전달체가 필요하다. RNAi 간섭 현상을 적용하기 위한 두 가지 주요 siRNA 전달 시스템이 있다. 한가지는 바이러스를 이용한 전달체이고 다른 한가지는 바이러스를 사용하지 않는 전달체이다. 바이러스를 이용한 전달체 시스템은 siRNA 전달에 매우 효율적인 반면 바이러스가 가지고 있는 고유 특성으로 인하여 유전자 치료 적용에 있어 심한 부작용을 보일 가능성이 크다. 바이러스를 사용하지 않는 전달체의 경우 적은 세포독성을 가지고 있는 반면 치료 적용을 위해서는 전달 효율을 증가시키는 노력이 필요하다. 이것을 위해 많이 연구가 진행되고 있는데 그 중 한가지가 9개의 아르기닌이 연결된 펩타이드(R9)와 같은 세포 투과성 펩타이드(CPP, Cell Penetrating Peptide)를 사용하는 방법이다. 그러나 CPP만으로는 siRNA를 세포안으로 효과적으로 전달하지는 못한다. 이 논문에서는 세포 표면에 있는 수용체에 붙는 펩타이드나 항체를 R9 펩타이드에 붙여 siRNA 전달 효율을 증가시키는 방법에 대해서 연구를 진행하였다. 그리고 이러한 표적 리간드를 부탁한 CPP 펩타이드가 어떠한 방법을 통해 siRNA를 더 효율적으로 전달하는지에 대한 매커니즘 연구를 진행하였다. 연구된 매커니즘에 의하면 ligand-R9:siRNA 마이크로파티클은 세포막 위에서 축적되고 그 지점에서 일시적인 세포막 역위가 일어나게 된다 그리고 세포질 안으로 빠르게 siRNA를 전달하게 된다. 엔도사이토시스 후에 일어나는 siRNA 전달은 비교적 늦게 일어나는데 L-R9를 리간드에 붙인 경우에만 일어나며 프로티에이즈-저항성 D-R9에 비하여 더 오랜 시간 mRNA 발현 저해를 일으킨다. 이것은 엔도좀에서의 단백질 분해 활성과 중요하게 연관되어있는데, 엔도좀에서 세포질로 siRNA 전달을 위해서는 CPP의 부분적인 분해가 필요함을 의미한다. 결론적으로 CPP에 표적 리간드를 붙임으로 유전자 억제 기능을 하는 siRNA를 더 많이 전달할 수 있고 적은 siRNA를 사용하여 효과적인 치료 효과를 얻을 수 있다.
다음으로는 이 ligand-(L)R9를 두 가지 다른 질병 모델에 적용을 하였다. 우리는 니코틴 아세틸콜린 수용체 (nAchR, nicotinic Acetylcholine Receptor)에 특이적으로 붙는 광견병 바이러스 당단백질 (RVG, Rabies Virus Glycoprotein)에서 유래된 29개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 L-R9에 부착한 RVG-(L)R9 펩타이드를 사용하였다. 우리는 RVG-(L)R9를 사용한 폐 표피 세포 특이적으로 siRNA 전달이 마우스 천식 모델에서 기도 과민성 및 염증을 감소 시키는지를 평가 하였다. 알러지성 폐의 염증 및 기도 과민성은 T 도움 세포 타입2 (Th2) 사이토카인 IL-4와 IL-13가 각각의 폐 표피 세포에 존재하는 수용체와 결합하면서 발생한다. IL-13는 IL-4 신호전달에 관여하며, IL-4 수용체를 구성하는 알파체인(α-chain)이 포함 되어있는 멀티-서브유닛으로 된 수용체를 통하여 염증을 유발 시킨다. 우리는 폐 표피세포 표면에 발현하는 니코틴 아세틸콜린 수용체에 특이적으로 붙는 RVG-(L)R9를 이용하여 IL-4 수용체 알파유닛을 표적으로 하는 siRNA (siIL4Rα)의 치료 효과를 동물 모델에서 평가 하였다. 폐 기관 내 주사 방식을 이용하여 RVG-(L)R9:siIL4Rα를 효과적으로 폐로 전달하였다. 이 방법을 통해 siIL4Rα 만 처리해준 군과 비교하여, 적은 독성과 뛰어난 폐 표피세포 전달 및 목표 유전자의 발현 억제를 보여주었다. IL-4Rα의 발현 저하로 OVA-유도 천식 마우스 모델에서 기도 염증의 완화 및 천식 증상이 완화 됨을 보여주었다. 데이터를 통하여 RVG-(L)R9:siRNA를 이용하여 폐 표면세포 특이적으로 siRNA를 효과적으로 전달할 수 있으며, 호흡기 염증을 감소 시키기 위한 IL-4 수용체 알파체인의 발현 억제가 RNA간섭 현상을 기반으로 한 새로운 치료 방법이 될 수 있음을 보였다.
다음으로 종양 괴사 인자 (TNF-α, Tumor Necrosis Factor-alpha)를 표적으로 하는 RVG-(L)R9:siRNA의 관절 내 주사 방법의 효과를 류마티스성 관절염 마우스 모델에서 확인하였다. 대식 세포에서 분비되는 종양 괴사 인자는 류마티스성 관절염에서 중요한 역할을 한다. 우리는 염증 환경에서 더 많은 종양 괴사 인자를 생산하며, 무릎 부위에 존재하는 CD11b+ 대식 세포에 특이적으로 붙는 RVG-(L)R9의 관절 내 주사 방법의 효과를 평가 하였다. RVG-(L)R9의 관절 내 주사를 통해 활막 내의 니코틴 아세틸콜린 수용체를 발현하는 대식세포 특이적으로 siRNA를 전달하였다. RVG-(L)R9:siTNF-α의 관절 내 주사는 콜라겐 항체를 이용한 류마티스성 관절염 마우스 모델에서 관절염의 증상을 완화시키는 효과를 보였다. 이 결과를 통해 대식세포 특이적으로 종양 괴사 인자의 발현의 감소를 유도하는 RVG-R9:siTNF-α의 관절 내 주사 방법이 류마티스성 관절염을 치료할 수 있는 새로운 방법임을 보였다.
이 학위 논문에서 우리는 ligand-R9과 함께 siRNA가 세포내로 어떻게 전달이 되는가 대한 매커니즘을 평가 하였고 이것의 치료효과를 평가하기 위하여 류마티스성 관절염과 천식 2가지 질병 모델에 효능을 평가하였다. ligand-R9에 의한 siRNA 전달 방법은 부작용은 최소화하고, 목표 질병에 적용할 수 있는 새로운 방법임을 밝혔다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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