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Title Page

Abstract

Contents

1. Introduction 14

1.1. General introduction 15

1.2. Biomass energy 18

1.2.1. The importance of biomass energy 18

1.2.2. The use of biomass energy 18

1.2.3. Saccharification of biomass 22

1.2.4. Agar as biomass 22

1.3. β-agarase 27

1.3.1. Source of agarases 27

1.3.2. Families of agarase 29

2. Cloning and expression of β-agarase 32

2.1. Introduction 33

2.2. Methods and materials 36

2.2.1. Instruments 36

2.2.2. Reagents and culture medium 36

2.2.3. Cloning and expression of AgaB34 gene 39

2.2.4. Purification of recombinant AgaB34 45

2.2.5. Characterization of recombinant AgaB34 48

2.3. Results and discussion 51

2.3.1. Cloning of AgaB34 gene 51

2.3.2. Expression and purification of recombinant AgaB34 51

2.3.3. Characterization of recombinant AgaB34 60

2.4. Conclusion 69

3. A new agarase activity assay 70

3.1. Introduction 71

3.2. Methods and materials 75

3.2.1. Instruments 75

3.2.2. Reagents and culture medium 75

3.2.3. Preparation of enzyme solution 76

3.2.4. Development of new agarase activity assay 78

3.3. Results and discussion 79

3.4. Conclusion 85

4. Study of the catalytic mechanism of AgaB34 86

4.1. Introduction 87

4.2. Methods and materials 90

4.2.1. Instruments 90

4.2.2. Reagents and culture medium 90

4.2.3. Site-directed mutagenesis of AgaB34 93

4.2.4. Expression and purification of mutant enzymes 94

4.2.5. Characterization of mutant enzymes 96

4.3. Results and discussion 98

4.3.1. Site-directed mutagenesis of AgaB34 98

4.3.2. Characterization of AgaB34 mutants 104

4.4. Conclusion 113

5. Immobilization of recombinant AgaB34 114

5.1. Introduction 115

5.2. Methods and materials 120

5.2.1. Instruments 120

5.2.2. Reagents and culture medium 120

5.2.3. Purification of recombinant AgaB34 122

5.2.4. Immobilization of recombinant AgaB34 124

5.2.5. Characterization of immobilized enzymes 130

5.3. Results and Discussion 132

5.3.1. Immobilization of recombinant AgaB34 132

5.3.2. Characterization of immobilized enzymes 135

5.4. Conclusion 158

6. General discussion 159

7. Conclusion 164

References 167

국문초록 182

List of Tables

Table 1. Energy density of media 21

Table 2. Oligonucleotide primers used for the polymerase chain... 40

Table 3. Programming of the thermocycler for PCR reaction 42

Table 4. Purification of recombinant β-agarase (AgaB34) 57

Table 5. Substrate specificity of recombinant AgaB34 62

Table 6. The absorbance intensity and calculated enzyme reaction units... 84

Table 7. Substrate-binding positions in cleft structure of AgaA, AgaB... 102

Table 8. The thermal stability of the mutant variants of AgaB 103

Table 9. Primer design for AgaB34 mutants 105

Table 10. The kinetic results for the AgaB34 mutants 106

List of Figures

Figure 1. Outline of corn dry milling and ethanol production 20

Figure 2. The decomposition products of macroalgae 25

Figure 3. Structure of agarose 26

Figure 4. Scheme of glycosylation reaction of agarases 28

Figure 5. Construction of pET26-AgaB34E expression plasmid 44

Figure 6. Nucleotide sequence of AgaB34 gene and its deduced amino... 54

Figure 7. Optimal conditions for AgaB34 expression 56

Figure 8. Elution profile of the recombinant AgaB34 with DEAE-... 58

Figure 9. Electrophoresis of the recombinant Aga-B34 under... 59

Figure 10. Lineweaver-Burk plot to determine the kinetic parameters... 63

Figure 11. Optimal pH and pH stability of recombinant AgaB34 64

Figure 12. Optimal temperature and thermal stability of recombinant... 67

Figure 13. Effect of metal ions on recombinant AgaB34 68

Figure 14. Integrated absorbance as a function of the potassium iodide... 82

Figure 15. The dependence of the color intensity of the agarose-iodine... 83

Figure 16. The three-dimensional structure of agarase 89

Figure 17. Prediction of structure and binding mode of AgaB34... 99

Figure 18. Alignment of amino acid sequences of AgaA, AgaB and... 101

Figure 19. Optimal temperature and thermal stability of the T59K... 111

Figure 20. Optimal temperature and thermal stability of the T261I... 112

Figure 21. Classification of immobilization methods 116

Figure 22. Approaches to enzyme immobilization 117

Figure 23. Schematic procedure for aminoalkylation of silica 128

Figure 24. Schematic procedure for immobilization of enzyme 129

Figure 25. Optimal temperature and thermal stability of AgaB34... 136

Figure 26. Optimal pH and pH stability of AgaB34 immobilized with... 137

Figure 27. Reusability of AgaB34 immobilized with sodium alginate 138

Figure 28. Optimal temperature and thermal stability of AgaB34... 140

Figure 29. Optimal pH and pH stability of AgaB34 immobilized with... 141

Figure 30. Reusability of AgaB34 immobilized with alumina 142

Figure 31. Optimal temperature and thermal stability of AgaB34... 144

Figure 32. Optimal pH and pH stability of AgaB34 immobilized with... 145

Figure 33. Reusability of AgaB34 immobilized with DEAE-Sephacel 146

Figure 34. Optimal temperature and thermal stability of AgaB34... 148

Figure 35. Optimal pH and pH stability of AgaB34 immobilized with... 149

Figure 36. Reusability of AgaB34 immobilized with 3-APTES 150

Figure 37. Optimal temperature and thermal stability of AgaB34... 152

Figure 38. Optimal pH and pH stability of AgaB34 immobilized by... 153

Figure 39. Reusability of AgaB34 immobilized by cross-linking with... 154

Figure 40. Lineweaver-Burk plots to determine the kinetic... 157

초록보기

 본 연구에서는 바이오알코올의 제조과정에서 당화에 필요한 Agarivorans albus YKW-34 유래 재조합 β-agarase B(AgaB34)에 대한 생화학적 특성 및 응용에 대해 연구를 진행하였다. 재조합 AgaB34 를 대장균(Escherichia coli)에서의 발현양을 높이기 위하여 코돈을 최적화하였다. 또한 발현 유도제인 IPTG 의 첨가시간 및 농도에 대한 최적 조건을 탐색한 결과, 18% 향상된 결과를 나타내었다. 재조합 AgaB34 가 발현된 추출물(crude extracts)에 대해 황산암모늄 침전법과 DEAE-Sepharose 컬럼크로마토 그래피를 이용하여 재조합 AgaB34 를 정제한 결과, 약 14 배의 정제도와 59 %의 수율을 나타냈다. 재조함 AgaB34 에 대한 특성화 결과 아가로오스에 대한 Km, Vmax, kcat, kcat / Km 값은 각각 0.0238 mM, 49.623 μmol/mg/min, 40.526 /s, 1703.919 /s·mM 로 나타났으며, 최적 pH 는 7.0, 최적온도는 40 ℃ 를 나타냈으며, pH 5-9 에서 1 시간 및 50 ℃ 에서 30 분 보관 후에도 활성의 80% 이상을 유지하고 있었다. 또한, Cu2＋, Mn2＋, Zn2＋ 및 Al3＋ 이온이 AgaB34 활성을 강하게 저해하였다.

한편, 새로운 분석법인 ML 법을 개발한 결과 기존 30 분이던 활성측정시간을 5 분으로 줄일 수 있었으며, 아가로오스 분해속도를 측정할 수 있는 효소활성 측정법이 개발되었다. 그러나, 활성측정결과의 정밀성이 9%내외로 높게 나타나 향후 이 문제를 보완한다면 기존 β-agarase 활성측정법을 대체할 수 있을 것으로 보인다.

AgaB34 의 효소반응 메커니즘을 연구하고자 기질 결합부위로 알려진 틈새(cleft)구조의 기질결합 잔기에 대한 변이체를 부위특이적 변이법을 이용하여 만들어 변이체들에 대한 생화학적 특성을 조사하였다. 그 결과, 틈새(cleft)구조의 기질결합 잔기의 변이가 효소활성에 영향을 미쳤으며, AgaB34 의 활성이 다른 고활성을 갖는 β-agarase 보다 낮은 원인이 이들 부위의 치환에 따른 것임을 확인할 수 있었다. 또한, T59K 및 T261I 변이체에 대한 열안정성의 변화를 확인한 결과 열안정성이 5 ℃ 가량 상승 되었음을 확인할 수 있었다.

효소의 산업적 응용성을 높이기 위하여 최적의 고정화 방법을 탐색하였다. AgaB34 에 대해 포괄법(entrapment), 물리적 흡착법, 이온결합, 공유결합 및 가교법(가교화된 효소를 포괄법으로 고정)에 의한 고정화를 수행하고 이들의 특성화를 실시한 결과, 열안정성은 가교법 및 공유결합법이 가장 우수해 20 % 향상되었으며, pH 안정성은 가교법이 가장 우수한 40% 높게 나타났으며, 재활용성은 공유결합법이 3 회 반복 실험에도 50% 이상 활성을 유지하여 가장 우수하게 나타났으며, 효소반응의 최적온도는 가교법이 60 ℃ 로 가장 높게 나타났다. 따라서, 가교법이 가장 우수한 고정화방법임을 확인하였다.

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