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Contents

1. INTRODUCTION 12

1.1. Global warming and greenhouse gas 12

1.2. Methane (CH₄) 16

1.3. Methane production 19

1.4. Methane oxidation 22

1.5. Objectives of this study 26

2. CHAPTER I. Comparative survey of rumen microbial communities and metabolites across one caprine and three bovine groups using barcoded pyrosequencing and ¹H-NMR spectroscopy 27

2.1. INTRODUCTION 28

2.2. MATERIALS AND METHODS 31

2.2.1. Animals and rumen sampling 31

2.2.2. qRT-PCR to estimate the numbers of Bacteria, Archaea, and protozoa 32

2.2.3. PCR amplification for barcoded pyrosequencing 33

2.2.4. Pyrosequencing and data analysis 35

2.2.5. Metabolite profiling of rumen fluids and statistical analysis 36

2.2.6. Nucleotide sequence accession numbers 37

2.3. RESULTS 38

2.3.1. Hanwoo steers: Influence of diet and age on rumen metabolites 38

2.3.2. Hanwoo steers: Influence of diet and age on rumen microbial community composition assessed by qRT-PCR and pyrosequencing 43

2.3.3. Expanding the study to Holstein-Friesian cows and Korean native goats 49

2.3.4. Statistical comparison of rumen metabolites and microbial community compositions among all four ruminants 54

2.4. DISCUSSION 61

3. CHAPTER II. Methane emission and dynamics of methanotrophic and methanogenic communities in a flooded rice field ecosystem 64

3.1. INTRODUCTION 65

3.2. MATERIALS AND METHODS 68

3.2.1. Rice field experiments 68

3.2.2. Measurement of CH₄ emission rates 68

3.2.3. Soil sampling and analysis of soil properties 69

3.2.4. Quantitative PCR of 16SrRNA, pmoA, and mcrA in extracted soil DNA 70

3.2.5. Quantitative reverse transcriptase PCR for the expressional analysis of pmoA and mcrA genes 71

3.2.6. PCR amplifications for pyrosequencing 71

3.2.7. Data analysis of pyrosequencing reads 74

3.2.8. Statistical analysis 75

3.2.9. Nucleotide sequence accession number 76

3.3. RESULTS 77

3.3.1. Chemical properties of rice paddy soil and methane emission rates 77

3.3.2. Abundances of total Bacteria, Archaea, methanotrophs, and methanogens in rice paddy soil 79

3.3.3. Expression of pmoA and mcrA genes in rice paddy soil 81

3.3.4. Bacterial and archaeal community analysis 83

3.3.5. Statistical analyses and a single, composite parameter to predict methane emissions 97

3.4. DISCUSSION 104

4. CHAPTER III. High resolution depth distribution of Bacteria, Archaea, methanotrophs, and methanogens in the bulk and rhizosphere soils of a flooded rice paddy 109

4.1. INTRODUCTION 110

4.2. MATERIALS AND METHODS 113

4.2.1. Rice paddy description and soil sampling along a depth gradient 113

4.2.2. Analysis of methane and TOC concentrations 115

4.2.3. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) 116

4.2.4. Analysis of the bacterial and archaeal community structure using pyrosequencing 116

4.2.5. Nucleotide sequence accession number 119

4.3. RESULTS 120

4.3.1. Vertical profiles of oxygen, methane, and TOC concentrations 120

4.3.2. Abundances of Bacteria and Archaea along a depth gradient 122

4.3.3. Bacterial and archaeal community composition along a depth gradient 124

4.4. DISCUSSION 136

5. CONCLUDING REMARKS 140

6. REFERENCES 143

7. 국문초록 164

8. ABSTRACT 167

Table 1.1. The atmosphereic composition of the main gases(nitrogen and oxygen)... 14

Table 1.2. Components of annual average global carbon budget for 1980s, 1990s of... 15

Table 1.3. Estimated sources and sinks of methane in millons of tonnes per year 18

Table 1.4. Distribution of pMMO and sMMO of methanotrophic genera known to... 24

Table 2.1. List of adapter and barcode sequences in the PCR primer sets used in this... 34

Table 2.2. The ratios of concentrate ration to roughage in feeds and pH values and microbial abundances of rumen fluid samples... 40

Table 2.3. Concentrations of metabolites identified in the rumen fluids of Hanwoo... 42

Table 2.4. Summary of the pyrosequencing data and statistical analysis of bacterial... 46

Table 3.1. List of adapter and barcode sequences in the PCR primer sets used in this... 73

Table 3.2. Chemical properties of rice paddy soil and methane emission rates during the rice cultivation period 78

Table 3.3. Summary of pyrosequencing data and statistical analysis of bacterial and... 84

Table 3.4. Summary of pyrosequencing data and statistical analysis of... 95

Table 3.5. Pearson correlation coefficients and P values between methane emission... 101

Table 4.1. Sequence information of the barcodes and adapters used in this study 118

Table 4.2. Statistical analysis of the normalized 16S rRNA gene sequencing data... 125

Figure 1.1. Pathway of degradation of organic matter to methane under anaerobic... 21

Figure 2.1. Representative ¹H-NMR spectra (0-9 ppm) of the rumen fluids from... 41

Figure 2.2. Rarefaction curves of bacterial (A) and archaeal (B) 16S rRNA gene... 47

Figure 2.3. Bacterial (A and B) and archaeal (C and D) taxonomic compositions of... 48

Figure 2.4. A phylogenetic dendrogram based on 16S rRNA gene sequences... 53

Figure 2.5. Score plot of principal component analysis (PCA) of rumen metabolites... 55

Figure 2.6. Hierarchical clustering of bacterial (A) and archaeal (B) communities in... 58

Figure 2.7. PCoA results showing the relationships of bacterial (A) and archaeal (B)... 59

Figure 2.8. Hierarchical (A, B) and PCoA (C, D) relationships of bacterial (A, C)... 60

Figure 3.1. Changes in the 16S rRNA gene copy numbers for total Bacteria (A) and... 80

Figure 3.2. Transcript abundances (A and B) and transcript/gene ratios (C and D) of... 82

Figure 3.3. Rarefaction curves showing bacterial (A) and archaeal (B) diversities in... 85

Figure 3.4. Bacterial (A and B) and archaeal (C and D) taxonomic compositions... 88

Figure 3.5. Changes in methanotrophs (A and C) and methanogens (B and D)... 90

Figure 3.6. The weighted UniFrac clustering (A and B) and PCoA (C and D) results... 92

Figure 3.7. Rarefaction curves showing pmoA (A) and mcrA (B) diversities in the... 96

Figure 3.8. The weighted UniFrac clustering (A, B) and PCoA (C, D) relationships... 98

Figure 3.9. Canonical correspondence analysis(CCA) showing the relationships... 100

Figure 3.10. Relationship between net methane flux from field rice-paddy soils... 103

Figure 4.1. A schematic diagram showing sampling points of bulk and rhizosphere... 114

Figure 4.2. Profiles of oxygen, methane (A), and total organic carbon(TOC) (B) concentrations along a depth gradient in the... 121

Figure 4.3. Profiles of the 16S rRNA gene copies for total Bacteria (A) and Archaea (B) along a depth gradient in the bulk and... 123

Figure 4.4. Profiles of Chao1 and Shannon-Weaver indices for total Bacteria (A) and Archaea (B) along a depth gradient in the... 126

Figure 4.5. The weighted UniFrac clustering (A and B) and PCoA (C and D)... 128

Figure 4.6. Taxonomic compositions of bacterial (A and B) and archaeal (C and D)... 130

Figure 4.7. Relative abundances of putative methanotrophs (A and B) and... 133

Figure 4.8. Estimated absolute abundances of putative methanotrophs (A and B) and... 135

 메탄(CH₄)은 이산화탄소 다음으로 중요한 온실화가스이다. 지구에서의 메탄순화를 이해하기 위해, 본 연구에서는 두 가지 주요 메탄 방출 원인 반추위와 논토양에서 메탄생성균 및 산화균의 특징을 조사하였다.

한우 육성우(HGS), 한우 비육우(HFS), 젖소(HDC)와 염소(KNG)에서의 반추위 내 미생물 군집과 대사체분석을 위해 총세균 및 고세균의 16S rRNA 유전자의 바코드-파이로시퀀싱과 ¹H-NMR 기법을 각각 사용하였다. 대사체 및 반추위 미생물 군집을 이용한 통계적 비교는 나이 및 식이가 다른 HFS 와 HGS 에서는 유의한 차이가 없음을 나타내었다. 총세균 중 Bacteroidetes, Firmicutes, Fibrobacteres 와 Proteobacteria 문이 모든 반추위에서 우점하고, Fibrobacteres 문만이 KNG 에서 매우 낮은 양(＜0.1%)이 있음을 생물정보학분석을 통해 확인하였다. 고세균 군집분석결과 거의 모든 염기서열들(sequencing reads)이 기존에 배양된 메탄생성균과는 떨어져있지만 연관은 되어있는 것으로 분석되었다. KNG 의 대사체 및 미생물군집은 다른 반추동물들과는 분명히 분리되는 것으로 통계분석을 통해 확인하였다. 추가적으로 HGS 와 HDC 의 세균 군집 및 대사체 프로파일이 비슷한 식이를 섭취했음에도 서로 다른것으로 조사되었다. 본 연구에서는 반추동물이 섭취하는 식이보다 반추동물의 종이 반추위에서 미생물군집과 대사체 프로파일을 결정하는 핵심요소임을 확인하였다.

논토양에서의 메탄방출량을 메탄생성균 및 산화균과 토양의 화학적특성과 함께 조사하였다. 메탄방출량은 모내기 후 증가하였고(7.2 mg/일∙㎡부터 552 mg/일∙㎡), pmoA 와 mcrA 유전자 발현량, mcrA 발현량/유전자 비, 온도 및 총유기탄소와 긍정적이고 유의성있는 상관관계를 보인 반면, 황산농도와는 부정적 상관관계를 나타냈다. 메탄산화균은 총세균의 16S rRNA 유전자염기서열들 중 단 0.79–1.75%로 작은 비율을 차지하는것으로 조사되었다. 유형II 메탄산화균인 Methylocystis 는 모내기 후 매우 빠르게 감소한 반면 Methylosinus 와 미분류된 Methylocystaceae(유형 II)는 벼재배기간동안 비교적 일정하게 유지하는 것으로 나타났다. Methylocaldum, Methylobacter, Methylomonas 와 Methylosarcina (유형 I)는 초기기간동안은 매우 적은 비로 존재하다가, 60 일 이후부터 증가하여서 최대존재비는 90–120 일에 관찰되었다. 33,318 개의 고세균 염기서열들 중 68.3–86.6%가 메탄생성균으로 분류되었고, 메탄생성균들 중 Methanosaeta, Methanocella, Methanosarcina 와 Methanobacterium 이 우점하는 것으로 나타났고, 최대존재비로 60–90 일에 관찰되었다. 단 4 개의 염기서열들만이 혐기적 메탄산화균으로 분류되어, 혐기적 메탄대사는 논토양에서는 무시할 수 있음을 시사하였다. 결과들을 통합하여 다변량 정준상관분석을 수행한 결과 정규화된 mcrA/pmoA 유전자 발현량의 비율은 논토양에서의 메탄방출을 예측할 수 있는 유망 매개 변수로 활용할 수 있음을 찾을 수 있었다.

논토양에서의 총세균 및 고세균을 산소, 메탄과 총유기탄소의 농도와 함께 깊이에 따라 조사하였다. 비근권과 근권에서의 메탄, 총유기탄소 농도 및 미생물의 다양성은 깊이에 따라서는 비슷하게 조사되었지만, 메탄, 총유기탄소 농도 및 16S rRNA 유전자 수는 비근권보다 근권에서 더 높게 나타났다. 산소농도는 표면에서부터 줄어들어 8 ㎜ 에서 검출한계점 아래로 조사되었다. 16S rRNA 유전자의 파이로시퀀싱을 수행한 결과 세균과 고세균의 군집이 호기, 호기-혐기과 혐기영역에 따라 서로 다른것으로 나타났다. 호기적 메탄산화균은 호기-혐기 영역 부근에서 가장 많이 나타난 반면, 메탄, 총유기탄소 및 메탄생성균은 근권의 30–200 ㎜ 깊이에서 가장 높은것으로 조사되어, 메탄은 벼로부터 기인된 유기탄소를 이용하여 생성되고, 호기적조건에서 대사된다는 것을 제시하였다. Methylococcus, Methylomonas 와 Methylocaldum 과 같은 유형 I 메탄산화균의 상대적 빈도는 유형 II 메탄산화균(Methylocystis, Methylosinus)에 비해 깊이가 깊어짐에 따라 크게 감소하는것으로 나타났다. 메탄생성균 중 Methanosaeta 와 Methanoregula 가 모든깊이에서 우점하였고, Methanosaeta, Methanoregula, Methanosphaerula 및 GOM_Arc_I 은 깊이에 따라 증가하였다. 근권과 비근권의 깊이에 따른 (특히 표면에서의 밀리미터 규모) 메탄생성 및 산화균의 절대존재비의 대조를 통해 메탄생성균중 Methanosaeta, Methanoregula, Methanocella, Methanobacterium 및 Methanosphaerula 이, 메탄산화균중 Methylosarcina, Methylococcus, Methylosinus 와 미분류된 Methylocystaceae 가 in situ 에서 생리학적 활성을 가지는 것으로 규명하였다.