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Title Page
Abstract
Contents
1. Introduction 13
1-1. Basic structure of estrogen receptor 13
1-2. Estrogen Receptor Mediated Cell Signaling 15
1-3. Estrogen and inflammatory 22
1-4. Hypoxia 22
1-5. Inflammation and Cyclooxygenase-2 28
1-6. Hypoxia and inflammation 32
1-7. Inflammation and ROS 34
1-8. Proliferation of VSMCs 36
1-9. Migration of VSMCs 37
2. Materials and methods 40
2-1. Reagents 40
2-2. Cell culture and hypoxic conditions 43
2-3. Plasmids 43
2-4. Transfection and luciferase assays 44
2-5. Quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) 45
2-6. VEGF ELISA 48
2-7. Western blot analysis 48
2-8. Immunoprecipitation 49
2-9. ROS Measurement by Flow Cytometry 49
2-10. Cell invasion and migration assays 50
2-11. Cell proliferation Assay 51
2-12. Statistical analysis 52
3. Results 53
3-1. Effects of ERβ on ARNT degradation 53
3-2. Ligand-involved ERβ suppress HIF-1 pathway in ERβ-positive PC3 cells 56
3-3. Ligand-involved ERβ suppress HIF-1 pathway in ERβ-positive Colo205 cells 60
3-4. Overexpression of ERβ is adequate to suppress the transactivation of HIF-1 62
3-5. ERβ suppresses hypoxia-induced invasion 65
3-6. ERβ interacts with HIF-1α under hypoxic conditions 68
3-7. Overexpression of ERα does not suppresses hypoxia induced VEGF 70
3-8. Induction of EMT marker by ERα under hypoxic conditions 72
3-9. In-Cl induced Estrogen receptor transcriptional activity 74
3-10. ERβ agonist inhibits hypoxia induction of COX-2 expression in VSMC 76
3-11. Effect of In-Cl inhibit hypoxia-induced activation of COX-2 expression 79
3-12. Attenuation of reactive oxygen species by In-Cl under hypoxia 81
3-13. In-Cl prevents cellular migration of hypoxia induced VSMCs 83
3-14. In-Cl prevents cellular invasion of hypoxia induced VSMCs 86
3-15. Effects of In-Cl on the proliferation of PDGF-BB-induced VSMCs 88
4. Discussion 91
5. References 96
국문초록 140
Figure 1. Organization of the estrogen receptor protein 14
Figure 2. Estrogen receptor ligand-dependent pathway 20
Figure 3. Estrogen receptor ligand-independent pathway 21
Figure 4. The scheme of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) alpha and beta 26
Figure 5. The scheme of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) pathways 27
Figure 6. Structure of the COX-2 31
Figure 7. Chemical structure of estrogen receptor agonists 41
Figure 8. Chemical structure of estrogen receptor antagonists 42
Figure 9. ERβ regulates ARNT and CYP1A1 expression level 54
Figure 10. DPN inhibits HIF-1 in PC3 cells with endogenous ERβ 58
Figure 11. DPN inhibits HIF-1 in Colo205 cells with endogenous ERβ 61
Figure 12. ERβ attenuates HIF-1 mediated gene transcription but ERβ agonist had... 63
Figure 13. ERβ inhibits cell invasion under hypoxic conditions 66
Figure 14. ERβ interacts with HIF-1α 69
Figure 15. ERα does not suppresses VEGF 71
Figure 16. ERα does not affect EMT marker under hypoxia 73
Figure 17. Estrogen receptor transcriptional activity is increased by ERβ agonist... 75
Figure 18. ERβ agonist decreases COX-2 expression but ERα agonist had no... 77
Figure 19. Effect of In-Cl inhibit hypoxia-induced COX-2 transcriptional activity... 80
Figure 20. In-Cl reduces reactive oxygen species under hypoxia 82
Figure 21. In-Cl inhibits cellular migration of VSMCs induced by hypoxia 85
Figure 22. In-Cl inhibits cellular invasion of VSMCs induced by hypoxia 87
Figure 23. In-Cl reduces proliferation in VSMC under hypoxia 89
Figure 24. Suggested model for the role of ERβ under hypoxia 90
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에스트로겐 수용체 베타 (ERβ) 는 암의 전이, 기능 및 발달의 예방에 중요한 역할을 할 것으로 예측된다. ERβ의 과발현이 유비퀴틴화 과정을 통한 HIF-1β (아릴 탄화수소 수용체 핵 이동자, ARNT) 분해를 통해 HIF-1 매개 전사를 억제한다는 것을 이전에 보여주었다. 이 연구는 저산소 상태에서 DPN 또는 Indazole-Cl (In-Cl) 과 같은 에스트로겐 수용체 베타 작용제의 보호 효과를 시험하기 위해 시도되었다. ERβ 특이적 작용제 디아릴프로피오니트릴 (DPN) 은 PC3 세포에서 에스트로겐반응인자 (ERE) – 루시퍼라제 활성을 에스트라디올과 유사하게 활성시켰다. PC3 세포에서 DPN이 ARNT 단백질 수준을 감소시켜 저산소에 의해 증가된 저산소반응인자 (HRE) - 루시퍼라아제 리포터 유전자 활성화의 감소를 유도한다는 것을 확인했다. PC3 세포에서 DPN 처리로 혈관내피성장인자 (VEGF)의 발현이 감소되었고 ERβ 특이적 길항제인 PHTPP에 의해 이 효과가 없어졌다. 다음으로 ERβ가 과발현된 MCF-7 세포에서 DPN의 효과를 조사했다. ERβ에 의한 HIF-1 전사 활성 억제는 HRE-루시퍼라제 분석으로 조사한 결과 DPN에 의해 더 감소되지 않았다. ERβ의 발현은 저산소 상태 하에서 VEGF 분비 및 ARNT 발현을 유의하게 감소시켰다. 그러나, ERβ이 과발현된 MCF-7 세포에서는 이러한 억제에 DPN이 추가로 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 ERβ의 작용제 없이도 ERβ가 과발현된 시스템으로 HIF-1을 저해하기에 충분하다는 것을 보여준다.
다른 연구에 의하면 저산소증은 HIF-1α 및 사이클로옥시게네이즈-2 (COX-2) 유도와 연관되어 있음이 밝혀졌다. VSMC에서 In-Cl의 처리는 저산소 유발 COX-2 발현 수준을 In-Cl에 의한 용량 의존적 방식으로 억제하였고, In-Cl의 이러한 효과는 ERβ 길항제 인 PHTPP 및 ER 길항제 ICI에 의해 길항되었다. 또한, COX-2 mRNA 수준, 프로모터 활성 및 NF-κB 프로모터 활성의 저산소 유발 증가가 In-Cl에 의해 억제되었다. 저산소에 의한 세포의 이동과 침입은 In-Cl 발현에 의해 극적으로 감소되었다. 이러한 결과는 ERβ agonist가 저산소증에 의한 COX-2 발현 및 세포 침입을 억제함을 보여준다. ERβ 작용제에 대한 연구는 저산소 상태에서 증가되는 HIF-1을 감소시킴으로써 암세포의 진행을 억제시킬 것으로 기대된다. 또한 혈관의 보호에도 긍정적인 영향을 미칠 것으로 기대한다.
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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