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Title Page

초록

Abstract

Contents

Chapter 1. Introduction 12

Chapter 2. Materials & Methods 16

Chapter 3. Results 25

3.1. PI4P is an inner-leaflet lipid in microdomains on the plasma membrane of PC12 cells 25

3.1.1. PI4P is plasma membrane lipid in PC12 cells 25

3.1.2. Plasma membrane PI4P is generated by PI4K type IIIα 25

3.1.3. PI4P is concentrated in microdomainsat inner-leaflet of the plasma membrane 31

3.2. PI4P is required for syntaxin 1 microdomain formation in PC12 cells 35

3.2.1. Partial overlap of syntaxin1 and PI4P microdomains 35

3.2.2. Removal of PI4P reduces syntaxin1 clustering in PC12 cells. 35

3.3. The interaction of plasma membrane PI4P with SYT1-C2B is important for vesicle docking. 42

3.3.1. The C2B domain from SYT1 strongly binds to PI4P independently of Ca2+(이미지참조) 42

3.3.2. SYT1-mediated vesicle dockingis regulated by PI4P 49

3.4. Plasma membrane PI4P is required for SLP4-mediated vesicle docking 52

3.4.1. SLP4 is effector of Rab3A and Rab27A on secretory vesicles. 52

3.4.2. SLP4 is targeted to the plasma membrane through its C2A domain 52

3.4.3. The C2A domain from SLP4 binds to both PI4P and PI(4,5)P₂ 59

3.4.4. PI4P is required for SLP4-mediated vesicle docking 62

4. Discussion 66

Chapter 4. Conclusion 68

Bibliography 69

List of Tables

Table 1. Cloning strategies of plasmids 22

Table 2. List of antibodies 24

List of Figures

Fig. 1. Subcellular localization of phosphoinositide species. 14

Fig. 2. Distribution of phosphoinositide in in nerve terminals. 15

Fig. 3. Schematic for inter-molecular FRET assay to visualize plasma membrane-localized... 27

Fig. 4. PI4P is plasma membrane lipids in PC12 cells. 28

Fig. 5. Removal of plasma membrane PI4P with the PI4KIIIα inhibitor A1. 29

Fig. 6. Plasma membrane PI4P is generated by PI4KIIIα in PC12 cells. 30

Fig. 7. Comparison of conventional TIRM and TIRM-SIM image. 32

Fig. 8. Preparation of membrane sheets of PC12 cells. 33

Fig. 9. TIRF-SIM image of stained PI4P in a membrane sheet. 34

Fig. 10. Part of plasma membrane PI4P is co-localized with syntaxin 1 clusters in PC12 cells. 36

Fig. 11. Selective depletion of plasma membrane PI4P and plasma membrane PI(4,5)P₂. 37

Fig. 12. Removal of plasma membrane PI4P reduces fluorescence signals from stained syntaxin 1 on... 38

Fig. 13. Plasma membrane PI4P is required for syntaxin 1 microdomain formation. 40

Fig. 14. Removal of plasma membrane reduced the puncta density of syntaxin 1. 41

Fig. 15. Pseudojanin (PJ), a fusion of sac and INPP5E phosphatase domains. 43

Fig. 16. Schematic for the depletion of PI4P by rapamycin-induced PJ-Sac recruitment to plasma... 44

Fig. 17. Lipid modulating system for selectively depleting plasma membrane PI4P and plasma membrane... 45

Fig. 18. SYT1-C2B binds both PI4P and PI(4,5)P₂ at the plasma membrane. 46

Fig. 19. Treatment of A1 compound caused to dissociation of SYT1-C2B from the plasma membrane. 47

Fig. 20. Ca2+ in RB does not affect the Ca2+-independent binding of SYT1-C2Bto plasma membrane PI4P...(이미지참조) 48

Fig. 21. Schematic of single-vesicle docking assay performed with Dil-labeled and unlabeled vesicles. 50

Fig. 22. Single-vesicle docking assays were performed to count PI4P-containing t-vesicles docking on a PEG... 51

Fig. 23. Localization and function of Rab GTPases. 53

Fig. 24. Co-localization of SLP4 and synaptic vesicles in rat hippocampal neurons. 54

Fig. 25. Localization of six SLP deletion constructs. 55

Fig. 26. Co-localization of SLP4-RBD with Rab3 A and Rab27Ain PC12 cells. 56

Fig. 27. Co-localization of SLP4 deletion constructs with a plasma membrane marker in PC12 cells. 57

Fig. 28. SLP4-C2A interacts with both PI4P and PI(4,5)P₂ at the plasma membrane. 60

Fig. 29. Treatment of A1 compound caused to dissociation of SLP4-C2A from the plasma membrane. 61

Fig. 30. Recruitment of cytosolic Munc18-1 to the plasma membrane is dependent on SLP4-C2A. 63

Fig. 31. Effect of the deletion of plasma membrane PI4P and plasma membrane PI(4,5)P₂ on SLP4-mediated... 64

Fig. 32. Depletion of docked vesicles from the plasma membrane by removal of both plasma membrane... 65

Fig. 33. Schematic showing a model of vesicle docking mediated by SYT1 and SLP4 at PI4P/PI(4,5)P₂... 67

초록보기

포스포이노시타이드 (Phosphoinositide)는 세포막에 비교적 적은 양으로 존재하는 지질이지만 정전기적 상호작용을 토대로 세포막으로 이펙터 단백질을 모집함으로써 세포 생리학 측면에서 중요한 역할을 수행한다. 최근 원형질막에 존재하는 포스파티딜이노시톨 4-포스페이트 [PI4P]가 다양한 세포 과정에서 중요한 조절 인자로 대두되고 있다. 하지만 신경세포외유출 (neuronal exocytosis)에 있어서는 PI4P는 여전히 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트 [PI(4,5)P₂]의 합성 전구체로 알려져 있을 뿐, 그 자체로 어떤 역할을 하는지는 알려진 바가 없다. 우리는 신경내분비세포인 PC12 세포의 원형질 막을 구조 조명 현미경을 이용해 관찰함으로써 통해서 PI4P가 원형질 내막 미세영역 (microdomain)에 모여서 존재하고 있음을 알 수 있었다. 이러한 PI4P 클러스터는 소포 도킹에 필수적인 단백질인 신택신 1 (syntaxin 1)이 정전기적 성질에 의해 뭉치는 것에 관여했다. 우리는 신택신 1과 그리고 PI(4,5)P₂ 와의 결합을 통해 소포도킹을 조절한다고 알려진 시냅토태그민 1 (synaptotagmin 1)이 C2 도메인을 통해 칼슘에 비의존적으로 원형질막의 PI4P와도 결합한다는 것을 확인했다. 나아가 Munc18-1 의존적으로 신택신 1과 결합하며 소포도킹을 촉진한다고 알려진 시냅토태그민 유사 단백질 4 (synaptotagmin-like protein 4, SLP4) 역시 C2 도메인을 통해서 원형질막에 존재하는 PI4P 와 PI(4,5)P2에 모두 결합하는 것을 확인했다. 이러한 정전기적인 단백질-지질간의 결합은 소포를 원형질막내의 도킹 사이트로 모집하여 도킹을 촉진시키는 데 필수적인 역할을 하게 된다. 종합적으로, PI4P는 PC12 세포에서 원형질막의 정체성을 정의하는 지질 풀(lipid pool)에 기여하며, 나아가 정전기적 상호작용에 의해 세포 외 유출이 나타나는 부위에서 신택신 1 미세영역을 형성에 관여하고 엑소시틱 단백질을 모집함으로써 소포 도킹을 조절한다.

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