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Abstract

목차

제1장 서론 10

제2장 재료 및 방법 14

1. Isolation human PBMC and culture condition 14

2. Bacteriophage culture 15

3. Bacteriophage LPS removal and quantification 16

4. Extraction LPS by chloroform-methanol method 17

5. ELISA 18

6. Production of Mutant Bacteria using bacteriophage 19

7. Galleria mellonella injection and observation survival 19

8. Ply500 protein purification, Western blot analysis 20

9. Optimum conditions for ply500 activity 22

10. Halo assay 23

11. CFU test 23

12. Recombinant phage and culture 24

13. Statistical analysis 25

제3장 결과 및 고찰 26

1. Effects of Escherichia coli phages used for phage therapy on human PBMC 26

2. Phage weakens bacteria's toxicity 36

3. Purification and characterization of endolysin Ply500 41

4. Phage display of endolysin from Listeria phage A500 55

5. Phage displayed Ply500 did not lyse Listeria monocytogenes 58

제4장 참고 문헌 63

Table 1. Phage-induced cytokine production from human PBMCs. 33

Table 2. Host spectrum of Ply500. Bacteria were subjected to breaking... 52

Figure 1. Removal of endotoxin from phage preparation. Five E. coli... 27

Figure 2. Phage-induced cytokine production from human PBMCs. 8... 31

Figure 3. Toxicity of mutant bacteria. 10 randomly selected phage-... 38

Figure 4. Construction of pBT7-C-His vector expressing the gene... 42

Figure 5. A. SDS-PAGE gel analysis. To observe protein before and after... 43

Figure 6. Optimum conditions for ply500 activity. Various NaCI... 45

Figure 7. Ply500 showed its endolysin activity in a dose dependent... 47

Figure 8. Ply500 showed its endolysin activity in a time dependent... 48

Figure 9. Halo assay. Bacteria with damaged peptidoglycan layers... 50

Figure 10. A. Construction of bacteriophage used in the study. B. PCR... 57

Figure 11. Turbidity assay in various doses. 59

Figure 12. CFU test. Target bacteria were treated with various MOI of T7... 60

초록보기

Phage는 antibiotics를 대체할 수 있는 방법이며, immune response에 영향을 미치지 않는다는 지난 연구와는 달리 최근 연구 결과 innate immune response와 cytokine의 profile 변화를 야기하는 것으로 밝혀졌다.

본 연구에서는 먼저 phage가 immune response에 미치는 영향을 살펴보기 위해 Escherichia coli phage 5종을 선정하여 in vitro에서 human의 peripheral blood mononuclear cell (PBMC)를 자극시키고, 이에 따른 cytokine의 변화를 ELISA를 통해 확인하였다. 이를 통해 phage가 innate immune response와 phagocytosis에 영향을 미치는 cytokine의 발현을 유도시킨다는 것을 확인하였다.

또한 phage resistant bacteria의 독성의 변화 여부를 알아 보기 위해서는 Galleria mellonella를 이용하여 Toxicity test를 시행하였고, phage resistant bacteria의 일부가 wild type에 비해서 독성이 약화된 것을 확인하였다.

마지막으로는 phage의 enzyme에 집중하여 Listeria monocytogenes를 사멸하는 Listeria phage A500의 endolysin을 purification, bacteria 사멸을 확인하였다. 이때, phage를 endolysin의 carrier로 사용하도록 T7의 capsid 10B에 ply500을 display하여 protein이 activity를 가지는지 확인하였으나 display된 endolysin의 유효한 antibacterial activity는 관찰되지 않았다.

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