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Title Page

Contents

Abbreviation Lists 7

I. Introduction 8

II. Materials and Methods 11

1. Preparation of RVHxR 11

2. Mouse splenocyte proliferation induced by Con A and LPS 11

3. Flow cytometric analysis (Determination of CD4+, CD8+ and CD4+/CD25+T lymphocytes in the spleen) 12

4. Th1- and Th2-type cytokine assay 13

5. IL-17 mRNA expressions in splenocytes 13

6. Cell culture 14

7. Cell viability assay 14

8. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 14

9. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) 15

10. Western blot analysis 15

11. Statistical analysis 16

III. Result 17

1. Splenocyte proliferation increased by Con A and LPS 17

2. RVHxR increased the percentages of T helper, T cytotoxic, and regulatory T cells 19

3. RVHxR increased cytokine release in splenocytes 23

4. RVHxR inhibited ConA and TGF-β-induced IL-17 production 25

5. RVHxR inhibited the viability of RAW 264.7 cells treated with LPS 27

6. RVHxR inhibited LPS-induced IL-17 production in RAW 264.7 cells 28

7. RVHxR inhibited the production of pro-inflammatory cytokines in RAW 264.7 cells 29

8. RVHxR inhibited LPS-induced activation of NF-κB and MAPK signaling in RAW 264.7 cells 32

IV. Discussion 35

V. Conclusion 39

References 40

Abstract 44

국문 초록 46

List of Figures

Figure 1. Con A (A) and LPS (B)-stimulated splenic lymphocyte proliferation in RVHxR-treated spleen... 18

Figure 2. (A). Effects of RVHxR on the percentage of CD4+ and CD8+ T cell subsets in mouse spleen... 20

Figure 2. (B). Effects of RVHxR on the percentage of CD4+ and CD8+ T cell subsets in mouse spleen... 21

Figure 3. Effects of RVHxR on the percentage of CD4+/CD25+ T cell subsets in mouse spleen cells.... 22

Figure 4. Effect of RVHxR on cytokine secretion. Splenic lymphocytes were stimulated by ConA for 24... 24

Figure 5. Effects of RVHxR on Con A and TGF-β-induced IL-17 cytokine mRNA expression in spleen... 26

Figure 6. Effect of RVHxR on the viability of LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. Cell viability... 27

Figure 7. Effect of RVHxR on the mRNA expression of LPS-induced IL-17 cytokines in RAW 264.7... 28

Figure 8. Effect of RVHxR on the level of inflammatory chemokines in LPS-stimulated RAW 264.7... 30

Figure 9. Effect of RVHxR on the level of inflammatory cytokines in LPS-stimulated RAW 264.7... 31

Figure 10. Effect of RVHxR on the activation of NF-κB in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages.... 33

Figure 11. Effect of RVHxR on the phosphorylation of MAPKs in LPS-stimulated RAW 264.7... 34

초록보기

목적: 옻나무 추출물인 RVHxR 이 항염증 작용뿐만 아니라 동물 세포에서 면역조절에 어떠한 효과를 가지는지 확인하여, 향후 류마티스 관절염등 자가 면역질환에 보다 근본적인 치료제로 활용되기 위한 효능 및 안전성 연구의 기초적 자료를 제공하고자 한다.

방법: 세포 내 실험으로, Con A 및 LPS 를 이용하여 쥐의 비장세포를 활성화시켰으며 다양한 농도의 RVHxR 을 투여한 후 세포 증식 정도를 측정하였다. cell viability 는 MTT assay 를 통하여 측정하였다. 유세포 분석기를 이용하여 T 림프구를 변화를 측정하였으며 Th1 cytokine 과 Th2 cytokine 분비 효과를 측정하기 위해 ELISA kit 을 사용하였다. RT-PCR을 통하여 IL-17, MCP-1, CXCL-10, IL-8 유전자 발현을 측정하였다. NF-κB, JNK1/2 의 인산화 정도를 Western blot을 통하여 확인하였다.

결과: RVHxR은 세포 생존도에 영향을 미치지 않으면서, Th-1 cytokine 분비를 높이고 중요한 염증 발현 물질인 IL-17 의 발현을 억제했다. 또한 염증성 cytokine 및 chemokine의 분비를 줄여 염증반응을 감소시켰으며 NF-κB, JNK1/2의 인산화를 억제시켰다.

결론: RVHxR은 T cell 과 Th1 cytokine 을 활성화 시키고 IL-17의 생산을 억제하는 면역 조절 활성을 가진다는 것을 확인했다. 본 연구를 기초로 RVHxR을 향후 자가 면역 질환 치료제로서 활용하기 위한 임상 연구의 적용이 가능하리라 기대된다.

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