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표제지

목차

List of abbreviations and symbols 15

제1장 서론 17

제1절 연구의 목적 및 범위 18

제2절 연구의 이론적 배경 및 연구 동향 20

1. 선복화의 특성 20

2. 선복화의 식물학적 분류 21

3. 선복화 유래 기능성 성분과 화학구조 23

4. 선복화 유래 기능성 성분의 생리활성 25

5. 선복화 관련 국내의 연구 동향 26

제2장 선복화 유래 Inularins A~F의 추출정제, 물리화학적 특성 및 화학구조 규명 29

제1절 서론 30

제2절 실험재료 및 방법 33

1. 실험재료 33

2. 시약 33

3. 실험기기 34

4. 선복화 추출 및 활성 성분의 분리 34

5. 선복화 추출물의 LC-MS/MS 분석 35

제3절 연구 결과 38

1. 기능성 물질의 추출 전처리 38

2. Inularins A~F의 순수 분리정제 40

3. Inularins A~F의 물리화학적 특성 및 화학구조 규명 41

4. 선복화 유래 활성물질의 LC-MS/MS 분석 79

제4절 고찰 84

제5절 요약 86

제3장 선복화 유래 Inularin A 및 D의 항산화 활성(ROS, △ψm, Nrf2, HO-1)[이미지참조] 87

제1절 서론 88

제2절 실험재료 및 방법 91

1. 공시재료 91

2. 세포주 및 배양 91

3. 세포 생존능 측정 93

4. ROS 소거활성 94

5. 세포내 Mitochondrial 막전위 (△ψm) 활성[이미지참조] 94

6. Western blot 분석을 통한 Nrf2/Ho-1 활성 95

7. 통계처리 95

제3절 연구결과 96

1. 세포독성 96

2. Reactive oxygen spices 소거활성 96

3. Mitochondria 막 전위 탈분극 활성 97

4. Nrf2/Heme oxygenase-1 활성 98

제4절 고찰 105

제5절 요약 106

제4장 선복화 유래 Inularin A 및 D의 미백활성 108

제1절 서론 109

제2절 실험재료 및 방법 112

1. 실험재료 및 세포배양 112

2. 세포 생존능 측정 112

3. 세포 내 melanin 함량 측정 113

4. 세포 내 Tyrosinase 저해활성 114

5. Western blot 분석 114

6. Zebrafish 사육 115

7. Zebrafish melanin 저해 실험 116

8. 통계 처리 116

제3절 연구 결과 117

가. Inularin A의 미백 효능 117

나. Inularin D의 미백 효능 125

제4절 고찰 136

제5절 요약 140

제5장 Inularin F의 항암 활성 및 세포주기·세포분화 조절 기전 141

제1절 서론 142

제2절 실험재료 및 방법 145

1. 공시재료 145

2. 세포주 및 배양 145

3. Antiproliferation assay 145

4. 세포의 현미경 관찰 146

5. Tetramethylrhodamine Methyl Ester (TMRM) assay 146

6. ROS 및 Mitochondrial Membrane Potential (△ψm)[이미지참조] 146

7. Cell Cycle Progression 147

8. Apoptosis Analysis 147

9. Western Blot Analysis 148

10. RT-qPCR 148

11. Confocal Imaging 149

12. Live/Dead Fluorescence Microscopy Assay 149

13. 통계분석 149

제3절 연구결과 150

1. Cell proliferation 150

2. Mitochondrial membrane potential 활성 151

3. 활성산소 (ROS) 소거활성 156

4. 세포주기 저해활성 156

5. 세포사멸 활성 158

6. NF-κB 저해활성 162

7. Live/Dead 세포 생존력 163

제4절 고찰 167

제5절 요약 170

제6장 종합고찰 171

제7장 결론 175

Abstract 178

참고문헌 183

표목차

Table 2-1. Analytical condition of HPLC. 36

Table 2-2. Analytical condition of Mass. 37

Table 2-3. The Physicochemical characteristics and spectroscopy data of Inularin A. 45

Table 2-4. ¹H-NMR (400 ㎒) and ¹³C-NMR (100 ㎒) data of Inularin A (in CD₃OD) 46

Table 2-5. The Physicochemical characteristics and spectroscopy data of Inularin B. 53

Table 2-6. ¹H-NMR (400 ㎒) and ¹³C-NMR (100 ㎒) spectrum of Inularin B (in CD₃OD). 54

Table 2-7. The Physicochemical characteristics and spectroscopy data of Inularin C. 58

Table 2-8. ¹H-NMR (400 ㎒) and ¹³C-NMR (100 ㎒) spectrum data compound 3 (in CD₃OD). 59

Table 2-9. The physicochemical characteristics and spectroscopy data of Inularin D. 64

Table 2-10. ¹H-NMR (400 ㎒) and ¹³C-NMR (100 ㎒) spectrum data of Inularin D (in CD₃OD). 65

Table 2-11. The physicochemical characteristics and spectroscopy data of compound 5. 70

Table 2-12. ¹H-NMR (400 ㎒) and ¹³C-NMR (100 ㎒) spectrum data of compound 5 (in CD₃OD). 71

Table 2-13. The physicochemical characteristics and spectroscopy data of compound 6. 75

Table 2-14. ¹H-NMR (400 ㎒) and ¹³C-NMR (100 ㎒) spectrum data of compound 6 (in CDCl₃). 76

Table 2-15. Chemical structure and molecular weight of Inularins A~F. 81

Table 2-16. Optimal parameter for LC/MS/MS. 82

그림목차

제1장 11

Fig. 1-1. The aerial parts of Inula lineariifolia, Inula japonica and Inula britannica. 24

제2장 11

Fig. 2-1. Extraction and purification of Inula britannnica 39

Fig. 2-2. Chemical structure of Inularin A 45

Fig. 2-3. HR-EI-MS spectrum of compound 1. 47

Fig. 2-4. UV spectrum (in MeOH) of compound 1. 47

Fig. 2-5. IR spectrum (in KBr) of compound 1. 47

Fig. 2-6. ¹H-NMR (400 ㎒) spectrum of compound 1 (in CD₃OD) 48

Fig. 2-7. ¹³C-NMR (100 ㎒) spectrum of compound 1 (in CD₃OD) 48

Fig. 2-8. ¹H-¹H COSY spectrum of compound 1 49

Fig. 2-9. HMBC spectrum of compound 1. 50

Fig. 2-1. NOESY spectrum of compound 1. 51

Fig. 2-11. Chemical structure of compound 2. 53

Fig. 2-12. ESI-MS spectrum of compound 2. 55

Fig. 2-13. UV spectrum (in MeOH) of compound 2. 55

Fig. 2-14. IR spectrum (in KBr) of compound 2. 55

Fig. 2-15. ¹H-NMR (400 ㎒) spectrum of compound 2 (in CD₃OD). 56

Fig. 2-16. ¹³C-NMR (100 ㎒) spectrum of compound 2 (in CD₃OD). 56

Fig. 2-17. Chemical structure of compound 3. 58

Fig. 2-18. ESI-MS spectrum of compound 3. 60

Fig. 2-19. UV spectrum (in MeOH) of compound 3. 60

Fig. 2-20. IR spectrum (in KBr) of compound 3. 60

Fig. 2-21. ¹H-NMR (400 ㎒) spectrum of compound 3 (in CD₃OD). 61

Fig. 2-22. ¹³C-NMR (100 ㎒) spectrum of compound 3 (in CD₃OD). 61

Fig. 2-23. Chemical structure of Inularin D. 64

Fig. 2-24. ESI-MS spectrum of compound 4. 66

Fig. 2-25. UV spectrum of compound 4. (in CH₃OH). 66

Fig. 2-26. IR spectrum (in KBr) of compound 4. 66

Fig. 2-27. ¹H-NMR (400 ㎒) spectrum of compound 4 (in CD₃OD). 67

Fig. 2-28. ¹³C-NMR (100 ㎒) spectrum of compound 4 (in CD₃OD). 67

Fig. 2-29. HMBC spectrum of compound 4. 68

Fig. 2-30. Chemical structure of compound 5. 70

Fig. 2-31. ESI-MS spectrum of compound 5. 72

Fig. 2-31. ¹UV spectrum of compound 5 (in CH₃OH). 72

Fig. 2-32. IR spectrum (in KBr) of compound 5. 72

Fig. 2-33. ¹H-NMR (400 ㎒) spectrum of compound 5 (in CD₃OD). 73

Fig. 2-34. ¹³C-NMR (100 ㎒) spectrum of compound 5 (in CD₃OD). 73

Fig. 2-35. Chemical structure of compound 6. 75

Fig. 2-36. ESI-MS spectrum of compound 6. 77

Fig. 2-37. UV spectrum of compound 6. 77

Fig. 2-38. IR spectrum (in KBr) of compound 6. 77

Fig. 2-39. ¹H-NMR (400 ㎒) spectrum of compound 6 (in CD₃OD). 78

Fig. 2-40. ¹³C~NMR (100 ㎒) spectrum of compound 6 (in CD₃OD). 78

Fig. 2-41. LC-MS/MS spectrum of compound 1~6. 80

제3장 12

Fig. 3-1. Chemical structure of Inularin A and Inularin D. 92

Fig. 3-2. Inularin A-induced changes in intracellular reactive oxygen species (ROS) levels in HaCat cells. (A) Measurement... 99

Fig. 3-3. Inularin D-induced changes in intracellular reactive oxygen species (ROS) levels in HaCat cells. (A) Measurement... 100

Fig. 3-4. Decrease in mitochondrial membrane potential in HaCat cells due to Inularin A. (A) Mitochondrial membrane... 101

Fig. 3-5. Decrease in mitochondrial membrane potential in HaCat cells due to Inularin D. (A) Mitochondrial membrane... 102

Fig. 3-6. Inularin A-induced apoptosis markers in HaCat cells. (A) Whole cell lysates from Inularin A treated cells were... 103

Fig. 3-7. Inularin D-induced apoptosis markers in HaCat cells. (A) Whole cell lysates from Inularin D treated cells were... 104

제4장 13

Fig. 4-1. Chemical structure of Inularin A and Inularin D. 120

Fig. 4-2. Effect of Inularin A on cell proliferation in B16F10 melanoma cells. After incubation of B16F10 melanoma cells... 121

Fig. 4-3. Effect of Inularin A on melanogenesis in B16F10 melanoma cells. B16F10 cells were stimulated with 100 nM α... 122

Fig. 4-4. Effect of Inularin A on tyrosinase activity in B16F10 melanoma cells. B16F10 cells were stimulated with 100 nM α... 123

Fig. 4-5. Effect of inularin A on melanin production in zebrafish embryos. Zebrafish embryos were treated with... 124

Fig. 4-6. Effect of Inularin D on cell proliferation in B16F10 melanoma cells. After incubation of B16F10 melanoma cells... 129

Fig. 4-7. Effect of Inularin D on melanogenesis in B16F10 melanoma cells. B16F10 cells were stimulated with 100 μM... 130

Fig. 4-8. Effect of Inularin D on tyrosinase activity in B16F10 melanoma cells. B16F10 cells were stimulated with 100 μM... 131

Fig. 4-9. Inhibitory effects of Inularin D on whitening related mRNA levels in B16F10 cells. B16F10 cells were stimulated... 132

Fig. 4-10. Inhibitory effects of Inularin D on whitening related protein expression in B16F10 cells. (A) B16F10 cells were... 133

Fig. 4-11. Effects of Inularin D on protein expression of p-AKT, p-ERK, and p-CREB in B16F10 cells. B16F10 Cells... 134

Fig. 4-12. Effect of inularin D on melanin production in zebrafish embryos. Zebrafish embryos were treated with... 135

Fig. 4-13. Mechanism of melanogenesis and pigmentation of Inularin A and D in human skin. 139

제5장 13

Fig. 5-1. Chemical structure of Inularin F. 152

Fig. 5-2. Anti-proliferative effects of Inula britannica HEDO on LY3 cells. Cell viability was assessed by the MTS assay at... 153

Fig. 5-3. Morphological changes in LY3 cells treated with Inularin F. Cells treated with Inularin F (10 and 20 μM) show... 154

Fig. 5-4. Decrease in mitochondrial membrane potential in LY3 cells due to Inularin F. (A) Mitochondrial membrane potential... 155

Fig. 5-5. Inularin F-induced changes in intracellular reactive oxygen species (ROS) levels in LY3 cells. (A) Measurement of... 159

Fig. 5-6. Altered cell cycle progression of LY3 cells due to Inularin F (10 μM). (A) Percentage of cells 10 the subG0/G1,... 160

Fig. 5-7. Altered apoptosis of LY3 cells due to Inularin F. (A) LY3 cells were either treated with Inularin F (10, 20 μM) or... 161

Fig. 5-8. Inularin F-induced apoptosis markers in LY3 cells. (A) Whole cell lysates from Inularin F treated cells were... 164

Fig. 5-9. Effects of Inularin F on p65 nuclear translocation in LY3 cells. LY3 cells were cultured in the presence or absence... 165

Fig. 5-10. Effects of Inularin F on cell viability 10 LY3 cells. (A) Merged fluorescence images showing untreated and... 166

Fig. 5-11. Graphic abstract of Inularin F. 169

초록보기

 선복화는 국화과에 속하는 금불초(Inula britannica Linne. var. japonica Thunb)의 꽃을 이르는 생약명으로 한방에서는 소담행수(消痰行水), 강기지구(降氣止嘔)의 효능이 있어 흉중담결(胸中痰結), 해천(咳喘), 수종(水腫)을 치료하는 약효가 있으며 혈맥을 잘 통하게 한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 선복화 추출물로부터 항산화, 미백 복합효능을 나타내는 기능성 성분의 추출정제, 물리 · 화학적 특성 규명 및 항산화, 미백 효능과 작용기전에 관한 일련의 연구를 수행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 선복화 추출물로부터 eudesmane sesquiterpene계 화합물 6종을 순수 분리 정제한 후 물리화학적 특성과 화학구조를 규명하여 Inularins A~F로 명명하였다. Inularin A는 본 연구에서 최초로 규명된 신규 화합물로 무색 분말이었으며 분자식은 C17H26O6이었고 HR-EIMS 분석결과 m/z 349.1626 [M+Na]+ (계산치 C17H26O6Na, 349.1627)로 분자량은 326.17이었다. 절대입체구조를 결정하기 위하여 선광도를 조사한 결과 선광도 [α]25D 값은 -20° (c ＝ 0.1, MeOH) 이었으며 최종적으로 1R, 4R, 5R, 7R, 8R, 10R의 absolute configuration을 갖는 화합물로 1β,4α-dihydroxy-8β-acetoxy-5αH-eudesma-11(13)-en-12-oic acid로 명명하였다.

2. 선복화 추출물로부터 분리한 eudesmane sesquiterpene계 화합물 중 Inularins B~F의 화학구조를 규명한 결과, 이들 화합물은 각각 C17H24O5 (MW 308.37), C15H22O4 (MW 266.33), C19H28O5 (MW 3336.42), C15H20O3 (MW 248.32), C15H20O3 (MW 248.32)의 화학식을 갖는 기지 화합물로 1-O-acetylbritannilactone, britannilactone, 6-O-isobutyryl-britanni lactone, 1β-Hydroxy alantolactone, 2α-Hydroxy-eudesma-4,11(13)-dien-12,8β-olide로 구조 동정 되었다.

3. 피부 각질 세포인 HaCaT cell을 이용하여 Inularin A 및 D의 활성산소 소거 능력을 조사한 결과, Inularin A 10 μM을 처리함으로 활성산소 발생량이 40.3%에서 24.1%로 감소하였으며 Inularin D는 그 효과가 더욱 뚜렷하여 0.3%까지 활성산소가 감소하여 Inularin A 및 D 화합물은 모두 항산화 효과가 매우 우수한 소재임을 확인하였다.

4. 미토콘드리아 막 전위 정도를 측정한 결과, Inularin A 및 D의 처리로 미토콘드리아 막 전위가 증가하였으며, Western blot 분석에서도 Inularin A 및 D 화합물 5 μM 처리에서 Nrf2 및 Ho-1의 발현이 크게 증가하여 세포의 산화 스트레스를 효율적으로 제어하고 있음을 확인하였다.

5. 선복화 유래 Inularin A의 미백활성을 조사한 결과, Inularin A를 100 μM 농도까지 처리하여도 세포독성은 나타나지 않아 안전한 화합물로 확인되었다. 세포 내 tyrosinase 저해 활성은 Inularin A 10~100 µM 처리시 농도 의존적으로 저해활성이 나타나기 시작하여 100 µM 처리시 약 33%의 tyrosinase 저해활성을 나타냈으며 멜라닌 합성도 약 40%가 억제되었다. 이와 같은 미백효과는 in vivo Zebrafish model에서도 유효하게 나타나 Inularin A 10 µM 처리시부터 현저한 멜라닌 색소의 감소가 확인되기 시작하여 100 □M 처리시 약 42%의 멜라닌 색소가 감소 되었다.

6. 선복화 유래 Inularin D의 미백 활성을 조사한 결과, Inularin D를 100 μM 농도로 처리하여도 세포독성은 나타나지 않아 안전한 화합물로 확인되었다. 세포 내 tyrosinase 저해 활성은 Inularin D 5~100 µM 처리시 농도 의존적으로 저해 활성이 나타나기 시작하여 100 µM 처리시 약 42%의 저해 활성을 나타냈으며 멜라닌 합성도 약 44%가 억제되었다. 이와 같은 미백효과는 in vivo Zebrafish model에서도 유효하게 나타나 농도 의존적으로 멜라닌 색소의 감소가 확인되었다.

7. 선복화 유래 Inularin D의 미백 작용기전을 밝히기 위하여 멜라닌 합성 관련 단백질의 발현 정도를 western blot을 통하여 분석한 결과, melanogenesis 과정 중 중요한 율속 효소인 tyrosinase, tyrosinase related protein-1(TRP-1) 및 tyrosinase related protein-2(TRP-2)의 발현을 억제하며 전사인자인 MITF의 발현을 억제함으로 미백활성이 나타남을 확인하였으며 이들은 p-AKT, p-ERK 및 p-CREB 복합 pathway를 통하여 발현되었다.

8. 선복화 유래 Inularin F의 항암활성 및 그 작용기전을 조사한 결과, mitochondrial membrane potential (TMRM)의 탈분극화를 유도하여 reactive oxygen species (ROS)를 상향 조절함으로 암세포의 apoptosis를 유도하였고 동시에 cell cycle 중 Sub-G0/G1 phase에서 세포주기가 제일 크게 정지됨을 확인하였다. 또 cleaved caspase-3, Bax, Bak, Noxa 유전자는 상향 조절된 반면, B-cell lymphoma 2 (BCL2), B-cell lymphoma-extra large (BCL-XL), nuclear factor-κB (NF-κB)는 하향 조절되었다.

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