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Title Page

Abstract

Contents

List of Abbreviations 11

1. Introduction 14

1.1. RNA tail as a control station 14

1.2. Adenylation and deadenylation in the RNA life cycle 15

1.3. Disease-associated deadenylases PARN and TOE1 16

2. Materials & Methods 20

2.1. Cell culture 20

2.2. siRNA transfection 20

2.3. RNA extraction 20

2.4. Immununocytochemistry 22

2.5. Quantitative real-time PCR 22

2.6. Western blot analysis 22

2.7. Library preparation for high-throughput sequencing 24

2.7.1. mTAIL-seq 24

2.7.2. RNA-seq for short ncRNAs 26

2.8. Bulk poly(A) tail assay 26

2.9. Northern blot analysis 27

2.9.1. Detection of short ncRNAs 27

2.9.2. Detection of 18S rRNA 28

2.10. Pseudouridine site mapping 28

2.11. Sucrose gradient fractionation 29

2.12. Telomerase activity assay 29

2.13. Poly(A) length measurement 30

2.14. Sequence processing and alignment of RNA-seq libraries 30

2.15. 3' end analysis of scaRNAs, snoRNAs, and snRNAs 31

2.16. Quantification and statistical analysis 31

2.17. Data and software availability 31

3. Results 32

3.1. PARN and TOE1 do not act on mRNA tails 32

3.2. PARN and TOE1 determine the 3 termini of nuclear small ncRNAs 35

3.3. PARN and TOE1 protect maturing scaRNAs from nuclear RNA surveillance 47

3.4. Pseudouridylation of snRNA is affected by scaRNA destabilization 53

3.5. TOE1 does not participate in 18S rRNA processing 54

3.6. TOE1 is involved in the 3' end processing of TERC 56

4. Discussion 60

5. Conclusion 64

6. Long Tables 66

Bibliography 100

국문초록 108

List of Tables

Table 1.1. Congenital disorders associated with PARN or TOE1. 18

Table 2.1. Target site sequences for siRNAs. 21

Table 2.2. Oligonucleotides used in quantitative real-time PCR. 23

Table 2.3. Oligonucleotides used in library preparation. 25

Table 2.4. Oligonucleotides used in northern blot probing. 27

Table 2.5. Oligonucleotide used in pseudouridine site mapping. 29

Table 2.6. Oligonucleotides used in telomerase activity assay. 30

Table 6.1. The list of protein-coding genes detected by mTAIL-seq. 66

Table 6.2. The list of ncRNAs detected by RNA-seq. 87

List of Figures

Figure 1.1. Schmeatic of an RNA tail. 14

Figure 1.2. Adenylation and deadenylation in prokaryotic and eukyarotic cells. 15

Figure 1.3. Diversity of human deadenylases. 16

Figure 1.4. Domain structures of human PARN and TOE1. 17

Figure 3.1. Subcellular localization of PARN and TOE1. 32

Figure 3.2. Immunofluorescence of PARN and TOE1 in siRNA-treated HeLa cells 33

Figure 3.3. Schematic description of the experimental procedure. 34

Figure 3.4. Validation of knockdown in HeLa cells. 34

Figure 3.5. Global distribution of poly(A) tail lengths (7-232 nt). 35

Figure 3.6. Mean poly(A) tail lengths of protein-coding genes. 36

Figure 3.7. Volcano plots showing the intragenic comparison of poly(A) lengths. 37

Figure 3.8. Poly(A) tail length distributions obtained from bulk poly(A) tail assay. 38

Figure 3.9. Poly(A) tag counts of protein-coding genes detected by mTAIL-seq 39

Figure 3.10. Distribution of RNA classes in RNA-seq libraries. 40

Figure 3.11. 3' enddistributionofscaRNAs, snoRNAs, andsnRNAs. 40

Figure 3.12. 3' end modifications found in control siRNA-treated cells. 41

Figure 3.13. Adenylation frequency of the metagene. 42

Figure 3.14. Length distribution of 3' adenosine tails. 42

Figure 3.15. Distribution of adenylation sites. 43

Figure 3.16. Box plots showing the adenylation frequency of each RNA class. 44

Figure 3.17. Adenylation frequency of individual ncRNAs. 45

Figure 3.18. Distribution of adenylation sites by RNA class. 46

Figure 3.19. Northern blot analysis of short ncRNAs upon PARN or TOE1 depletion. 47

Figure 3.20. Heat maps showing the 3' end distribution of individual ncRNAs. 48

Figure 3.21. qRT-PCR measurements of SCARNA8 and SCARNA13. 49

Figure 3.22. qRT-PCR measurements of SCARNA8 and SCARNA13 after 6-day knockdown. 50

Figure 3.23. RNA abundance and adenylation frequency from RNA-seq data. 50

Figure 3.24. Northern blot analysis of short ncRNAs upon knockdown of terminal nu-... 51

Figure 3.25. qRT-PCR analysis of SCARNA8 and SCARNA13 upon TENT4B depletion. 52

Figure 3.26. Pseudouridine residues of U5 snRNA detected by CMC labeling and primer extension. 53

Figure 3.27. Northern blot analysis of 18S rRNA. 54

Figure 3.28. Polysome profiling after deadenylase knockdown. 55

Figure 3.29. Distribution of RNA-seq reads corresponding to TERC. 56

Figure 3.30. qRT-PCR analysis of TERC level and adenylation frequency. 57

Figure 3.31. qRT-PCR analysis of TERC upon TENT4B knockdown. 58

Figure 3.32. Telomerase activity upon the depletion of PARN or TOE1. 58

Figure 4.1. Schematic illustration of 3' end maturation pathway. 60

Figure 4.2. Target specificity of PARN and TOE1. 61

Figure 4.3. Subnuclear localization is a possible factor determining the target specificity of... 62

초록보기

탈아데닐화 효소는 다른 뉴클레오사이드보다 아데노신을 선호하는 특수한 3'-5' 핵산외부가수분해효소이다. 아데노신 꼬리는 다양한 리보핵산(RNA) 분자의 3' 말단에 달릴 수 있고, RNA가 탈아데닐화 효소의 표적이 되게 한다. 대표적인 예로, 탈아데닐화 효소는 세포질에서 전령RNA의 아데노신 꼬리를 갉아먹고 엑소좀 복합체가 나머지 부분을 분해할 수 있게 한다. 또한 탈아데닐화 효소는 짧은 아데노신 꼬리를 제거하면서 전구체 마이크로RNA(miRNA)의 양을 조절하거나 성숙을 돕기도 한다. 척추동물은 독특한 특성을 가진 십여 개의 탈아데닐화 효소를 가지고 있고, 이 효소들이 RNA 대사에서 다양한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

그 중에서 PARN과 TOE1은 골수부전, 폐섬유증 또는 신경퇴행성 증후군과 같은 선천적 장애와 유전적으로 연관되어 있는 탈아데닐화 효소이다. 다른 탈아데닐화 효소와 달리 PARN 과TOE1은 주로 핵 과립에서 발견되며, 이 곳은 다양한 비암호화RNA(ncRNA)가 만들어지고 리보핵단백질 복합체(RNP)가 조립되는 장소이다. 많은 연구에서 PARN 및 TOE1의 RNA 기질 탐색을 시도했지만, 특정 RNA 종에 국한되어 있으며 아직까지 포괄적으로 다뤄지지 않았다. 그리고 비슷한 성질을 가진 PARN과 TOE1이 표적 RNA를 공유하는지 여부도 불분명한 상황이다.

이 논문에서 나는 전사체 분석을 바탕으로 PARN과 TOE1의 분자적 기능을 밝히고자 하였다. PARN과 TOE1을 고갈 후, mTAIL-seq과 RNA 서열분석을 적용하여 전령RNA와 짧은 ncRNA가 받는 영향을 각각 조사하였다. 그 결과, 나는 두 효소가 적어도 HeLa 세포에서 전령RNA의 꼬리 길이를 조절하지 않고, 오히려 핵에서 작용하는 짧은 ncRNA의 성숙을 촉진한다는 것을 발견하였다. 흥미롭게도, PARN과 TOE1은 작은 Cajal체 특이적 RNA(scaRNA)를 비롯한 일부 ncRNA에 중복적으로 작용하였다. PARN과 TOE1을 함께 고갈시켰을 때, scaRNA는 큰 폭으로 감소하였고 작은 핵 RNA(snRNA) 슈도유리딜화의 결함으로 이어졌다. 뿐만 아니라, PARN과 TOE1의 결핍은 텔로머레이즈 RNA(TERC)의 불완전한 성숙과 텔로미어 길이 유지 기능의 상실도 일으켰다. 이러한 관찰은 PARN과 TOE1이 전구체 ncRNA가 완전히 성숙하도록 하는 안전장치로 작용하고 RNP 기능을 유지하는 데 중요함을 시사한다. 마지막으로 TENT4B를 추가적으로 고갈시켰을 때, 아데노신 꼬리를 갖고 있는 전구체 RNA가 상당히 줄어들었고 scaRNA 및 TERC의 불안정화가 완화되었다. 따라서 TENT4B가 미성숙 ncRNA에 아데노신 꼬리를 만들고 PARN과 TOE1이 3' 말단을 끝까지 다듬을 수 있도록 한다.

이 논문에서는 대용량 서열분석을 적용함으로써 PARN과 TOE1의 RNA 표적을 밝히고, ncRNA 생합성에 대한 우리의 지식을 확장하였다. 표적 RNA에 대한 정보를 통해, PARN과 TOE1 관련 유전 질환에 대한 시각을 넓히고 치료법의 발견에 가까워질 수 있을 것으로 기대한다.

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