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Title Page

Contents

Abstract 11

Chapter 1. Background and Purpose of Thesis 14

1. Natural killer cells 14

1) Basic concepts of NK cell biology 17

2) NK cell receptors 17

3) NK cell effector function 20

4) NK cell expansion 21

2. Feeder cells 23

3. Irradiation 25

1) Definition and radiation unit 25

2) Types of radiation 26

3) Physical characteristics of radiation 27

4. Irradiators 30

5. Purpose of the current work 32

Chapter 2. X-rays as Irradiation Alternative for K562 Feeder Cell Inactivation in Human Natural Killer Cell Expansion 33

1. Introduction 33

2. Materials and Methods 35

1) Cell lines 35

2) Cytokines and antibodies 35

3) X-ray or gamma irradiation 36

4) Expansion of NK cells from PBMCs. 37

5) NK cell receptors and K562 ligand analysis 38

6) Evaluation of viability of K562 cells after X-ray or gamma irradiation 38

7) Percentage of non-replicating K562 feeder cells surviving after X-ray treatment or gamma irradiation during NK cell expansion 39

8) Flow cytometric cytotoxicity and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) assays 39

9) Statistics 40

3. Results 41

1) NKG2D ligand expression, viability, and percentage of surviving non-replicating X-ray-treated and gamma-irradiated K562 feeder cells 41

2) Cell expansion rate and purity 44

3) Expressions of NK cell receptors, cytotoxicity, and ADCC of expanded NK cells 45

4. Discussion 48

Chapter 3. Conclusion 51

REFERENCES 52

APPENDICES 62

Abstract 62

〈Appendix 1〉 Measurement of Radioactive Concentration from Chemical Fertilizers 64

1. Introduction 64

2. Materials and methods 68

3. Results 71

4. Discussion 72

〈Appendix 2〉 Conclusion 75

APPENDIX REFERENCES 82

논문요약 88

Table 1-1. Radiation units 25

Table 1-2. Types of ionizing radiation 26

Table 1-3. ICRP Publication 103 (2007): ICRP radiation weighting factors 27

Table 1-4. Comparison between gamma and X-ray irradiations 28

Figure 1-1. Calculation formula for the activity of isotope of Cs-137. 37

Figure 1-2. Flow cytometric characterization of NKG2D ligand expression on K562 cells after 24 h treatment with X-rays or gamma irradiation. 42

Figure 1-3. Viabilities of X-ray-treated and gamma-irradiated K562 feeder cells as well as the frequency of K562 feeder cells remaining in the expanded... 43

Figure 1-4. Purity and fold expansion of the expanded NK cells co-cultured with X-ray-treated and gamma-irradiated K562 feeder cells. 45

Figure 1-5. Expressions of surface receptors on expanded NK cells using X-ray-treated and gamma-irradiated K562 feeder cells. 46

Figure 1-6. Cytotoxicities of NK cells expanded using X-ray and gamma irradiated feeder cells against K562 and ADCC against Raji. 47

초록보기

배경: K562 (chronic myeloid leukemia cell line)는 인간의 자연살해세포(NK 세포) 증폭에 영양 세포로 널리 사용되어 왔다. 그런데, K562 는 만성골수성백혈병 환자에서 확립한 세포주이므로 NK 세포 증폭을 위해 공동배양(co-culture)시 불활성화가 필수적이다. 그간 불활성화를 위해 가장 널리 사용된 것은 감마선조사이지만, 일부 기관에서는 사용하기 어려워 그 대안이 모색되었다. 이에 본 연구에서는 K562 불활성화를 위한 감마선조사의 대안으로 X-선 조사를 가능성을 두 가지 방법으로 불활성화된 K562 영양세포를 활용하여 증폭된 NK 세포의 특성을 분석하여 확인하고자 하였다.

재료 및 방법: NK 세포를 증폭하기 위해, 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 X 선 (50 Gy) 및 감마선 조사 (50 Gy) 처리된 K562 세포와 IL-2 (10 ~ 100 IU/ml) 및 IL-15(10 IU/ml, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA), 10% FBS(Gibco, USA), 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Lonza, Walkersville, MD, USA)이 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 유세포 분석에 의해 증폭된 NK 세포 수용체, K562 의 리간드, 불활성 후 K562 의 세포생존도(viability), 배양액 중에 잔여 K562 의 비율, 암세포주에 대한 세포독성력 (cytotoxicity)과 항체 의존성 세포 독성 (antibody-dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC)를 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 얻은 K562 와 rituximab 이 부착된 Raji (human Burkitt's lymphoma cell line)로 각각 시행하였다.

결과: NK 세포 증폭률은 감마선 조사군(78±28.7)보다 X 선 처리군(68.9±32.6)에서 낮은 경향을 보였으나(p＝0.39) 큰 차이는 보이지 않았다. 또한, NK 세포 기능 또는 수용체 발현은 두 그룹에서 유사했습니다. 확장된 NK 세포에서 NK 세포 수용체(CD16, CD57, NKG2A, NKG2C, CD8a, NKP30, NKp46, CD62L, NKG2D, DNAM-1)의 발현 또한 두 그룹 사이에 유의한 차이가 없었습니다. X 선 처리 및 감마선 조사 K562 피더 세포에서 NKG2D 리간드의 세포 표면 발현은 유세포 측정법으로 검사되었습니다. X 선 및 감마선 조사 K562 세포는 치료되지 않은 K562 세포와 비교하여 HLA-ABC, ULBP1, ULBP2, ULBP3 수준이 유사한 반면, MICA 및 MICB 발현은 치료 후 4 시간 및 24 시간 증가했습니다. 그러나, 주요한 차이는 보이지 않았다.

결론: 본 연구에서 X 선 처리와 감마선 조사로 불활성화된 K562 에 의해 증폭된 두 군의 NK 세포의 특성이 유사함을 처음으로 증명하였다. 이러한 결과는 K562 영양세포의 불활성화에 X 선 조사가 감마선 조사의 대안으로 사용될 수 있어, 감마선 사용이 어려운 기관에서는 X 선 조사를 대안으로 활용될 수 있을 것이다.

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