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표제지

국문 요약

목차

서론 11

연구 방법 15

항체 및 시약 15

분자생물학 실험 15

세포 배양 실험 21

면역 블러팅 22

Streptactin 을 통한 EMC5 pulldown 23

ER-BioID 라벨링 23

펄스-체이스 실험 24

교차 연계자 처리 실험 25

당구배 실험 25

Bafilomycin-A1 및 MG132 처리 실험 26

연구 결과 27

EMC 결핍 세포주 제작 27

소포체 제한 비오틴 표지 모델 구축 27

EMC 표적 후보로서의 ARV1 28

EMC 매개 ARV1 올리고머 형성 30

EMC 매개 ARV1 리소좀 분해 경로 31

자가 포식기전에 의한 ARV1 분해 경로 32

고찰 66

참고 문헌 69

Abstract 74

표목차

표 1. Primer sequence 17

그림목차

그림 1. EMC5 결핍 세포주 제작 34

그림 2. EMC 기능 상실 확인 35

그림 3. ER-BioID 모델 구축 36

그림 4. ER-BioID 모델 확인 (1) 37

그림 5. ER-BioID 모델 확인 (2) 38

그림 6. ER-BioID 모델을 통한 비오틴화 단백질 추출 39

그림 7. EMC 결핍 세포주 정량 질량 분석 40

그림 8. HA-TEV-ARV1 모식도 및 발현 41

그림 9. EMC5와 ARV1간의 직접적인 연결 확인 (1) 42

그림 10. EMC 결핍 세포에서의 ARV1 전사 비교 43

그림 11. EMC 결핍에 의한 ARV1 구조 분석 44

그림 12. 교차 연계자에 의한 ARV1 올리고머 형성 분석 45

그림 13. DSP의 DTT에 의한 가역반응 분석 46

그림 14. GFP-P2A-RFP-ARV1 모식도 및 발현 47

그림 15. GFP-P2A-RFP-ARV1 발현 위치 분석 48

그림 16. ARV1* 발현위치 분석 49

그림 17. ARV1* 발현위치 분석 (2) 50

그림 18. ARV1*의 가용성 확인 51

그림 19. ARV1*의 밀도 구배 분석 52

그림 20. EMC매개 ARV1 올리고머 형성 53

그림 21. △EMC5 특이적 EMC 구성 단백질 분해 확인 54

그림 22. EMC4, EMC5, EMC8 결핍 세포주에서의 ARV1 발현 비교 55

그림 23. 과발현 신호 세기에 따른 ARV1 발현 비교 분석 56

그림 24. Cycloheximide 처리 후 ARV1 변동 분석 57

그림 25. ARV1* 리소좀 분해기전 분석 58

그림 26. ARV1*의 프로테아좀 분해기전 분석 59

그림 27. EATR 모델 제작 60

그림 28. EBSS에 의한 ARV1 이동 양상 확인 61

그림 29. ATG7 결핍 세포주에서의 ARV1 발현 분석 62

그림 30. ATG7 결핍 세포주에서의 ARV1 분해 분석 63

그림 31. EMC5 결핍 세포주에서의 ARV1 발현 분석 64

그림 32. EMC의 ARV1 올리고머 선택적 자가 포식작용 기전 65

초록보기

세포의 항상성 유지에 필수적인 기능을 하는 막 단백질들은 소포체에서 합성되며, 세포막에 삽입되는 구조적 특성상, 초기 생합성 과정이 그 기능을 결정하는 중요한 요인으로 고려된다. 최근, 이들 막 단백질의 삽입을 기질 선택적으로 용이하게 하는 소포체 막단백질 복합체 (Endoplasmic reticulum membrane protein complex, EMC)가 발견되었으며, 후속 연구들에게서 도출한 EMC가 막 삽입뿐 아니라, 번역 후 단백질 접힘과 분해 과정에 적극적으로 관여하고 있음을 시사하는 실험적 증거들과 더불어 EMC의 소포체 항상성 관문 조절 인자 (proteostasis checkpoint)로서의 기능이 주목되고 있다. 본 연구에서는, EMC 의존적 자가 포식작용을 입증함으로 EMC가 어떻게 기질 단백질을 선별하여 제거하는지에 대한 타당성 있는 분자 기전을 제시한다.

최적화된 소포체 제한적 단백질 근접 라벨링 (ER-restricted proximity labeling) 기술로 Arv1 (Acyl-CoA cholesterol acyl transferase-related enzyme 2 Required for Viability 1)을 신규 EMC 의존적 막 단백질로 검출하였다. 유전자 편집기 술과 다양한 생화학적 방법을 통해, Arv1이 소포체막에서 자발적으로 올리고머화 되며, EMC 결핍 세포에서의 Arv1 감소가 Arv1의 자발적 올리고머화 저해 때문임을 확인했다. Arv1 올리고머는 자가 포식기전을 통해 리소좀으로 이동된 후 분해되는 신규 소포체 매개 자가 포식기질 (ER-phagy substrate)일뿐 아니라, 자가 포식 기전을 소포체로 안내하는 신호인자로 작용한다. 반면에, EMC의 결핍에 기인한 Arv1 올리고머화 저해는 새로 합성된 Arv1의 자가 포식을 억제한다.

본 연구는, Arv1 매개 콜레스테롤 항상성에 관여하는 EMC의 생리학적 신규 기능뿐 아니라, 관련 인간 질환의 치료 타겟으로 EMC의 잠재적 타당성을 제시한다.

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