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표제지

목차

요약 8

CHAPTER Ⅰ. The role of rhino for male germline stem cell maintenance in Drosophila melanogaster spermatogenesis 10

Ⅰ. 서론 11

1. Drosophila melanogaster 정소의 stem cell niche 11

2. Transposable elements(TEs) 12

3. piRNAs(PIWI-interacting RNAs)에 의한 TEs 억제 기작 13

4. piRNAs source loci 14

5. 선행연구 및 연구목적 15

Ⅱ. 재료 및 방법 17

1. Fly stock 및 배양 조건 17

2. Reverse transcription PCR 17

3. Germline stem cells(GSCs) 정량화 및 통계 처리 17

4. Antibody staining 18

5. TUNEL assay with antibody staining 18

6. Quantitative RT-PCR 19

7. Stellaris RNA fluorescence in situ hybridization 19

8. FLP/FRT mosaic clonal analysis 21

Ⅲ. 결과 및 고찰 22

1. rhino 유전자 발현에 따른 수컷 생식 능력의 변화 22

2. rhino 기능 상실로 인한 정소 내 생식세포 감소 24

3. rhino 기능 상실로 인한 정소 내 생식줄기세포 감소 26

4. Male rhino mutant GSCs 감소의 onset point 28

5. rhino 기능 상실로 인한 정소 내 transposon activation 31

6. Male rhino mutant의 GSCs 감소 원인 35

7. rhino 기능 상실로 인한 JAK-STAT pathway 감소 39

Ⅳ. 결론 41

CHAPTER Ⅱ. Discovery of a suppressor for male rhino mutant germline phenotype in Drosophila melanogaster 43

Ⅰ. 서론 44

Ⅱ. 재료 및 방법 46

1. Fly stock 및 배양 조건 46

2. Germline stem cells(GSCs) 정량화 및 통계 처리 46

3. Antibody staining 46

4. Transposon qRT-PCR 47

Ⅲ. 결과 및 고찰 48

1. 개체 수준에서 male rhino mutant germline phenotype을 rescue하는 TML strain 48

2. 세포 수준에서 male rhino mutant germline phenotype을 rescue하는 TML strain 50

3. 세포 수준에서 male rhino mutant의 GSCs 감소를 rescue하는 TML strain 52

4. TML male rhino mutant의 transposon activation 54

5. TML male rhino mutant의 알려지지 않은 억제 인자가 genetic factor일 가능성 57

Ⅳ. 결론 60

Ⅴ. 참고문헌 61

Abstract 69

표목차

Table 1. RT-PCR primers 17

Table 2. qRT-PCR primers 19

Table 3. RNA in situ hybridization probe sequences 20

Table 4. qRT-PCR primers 47

초록보기

 진화 과정에서, 생식세포는 PIWI-interacting RNAs를 사용하여 mobile elements로부터 genome을 보호해왔다. 유전체 내 특정 heterochromatin 지역에서 heterochromatin protein 1d(HP1d, rhino)에 의해 piRNA precursor 전사가 유도된다고 알려져 있다. Female germline에서 rhino는 piRNA 생산을 통해 transposon을 silencing함으로써 genome 안정성 유지에 기여한다고 알려져 있다. Rhino 기능에 결함이 생길 경우 불임 형질을 보이는데, 아직 수컷 생식선에서의 역할에 대한 체계적 연구가 미흡하다. 본 연구에서는 male germline에서 rhino mutant의 역할을 집중적으로 분석하였는데, 흥미롭게도 germ cell과 germline stem cells(GSCs)의 loss가 나타남을 관찰하였다. 성체로의 우화 직후 생식세포를 거의 찾아볼 수 없는 female과 달리, male rhino mutant는 우화 직후 생식세포 수의 큰 변화가 나타나지는 않으나, 7일 이내 점차 사라지는 형질을 발견하였다. 원인을 알기 위해 male GSCs 수를 관찰하였는데, pupa 시기부터 우화 후 며칠 뒤까지 급감하는 형질을 확인하였다. 따라서, 성체로의 우화 후 관찰되는 생식세포 감소는 GSCs 수의 감소 때문인 것을 알 수 있다. 정상 rhino 유전자를 이용한 rescue construct를 지닌 초파리 line에서는 생식줄기세포 수가 회복되는 것을 보아 GSCs 수의 감소가 rhino 유전자 기능 상실 때문임을 알 수 있다. 수컷 GSCs 수 감소가 세포 사멸 때문인지 알기 위하여 세포 사멸 marker인 TUNEL 실험을 수행한 결과, TUNEL positive GSCs 를 전혀 발견할 수 없었다. 수컷 rhino 돌연변이체의 생식줄기세포는 세포 사멸이 아닌 다른 가능성 때문임을 시사하는데, age-dependent한 GSCs 감소가 GSCs의 self-renewal activity의 결함 때문인지 알기 위해 FRT/FLP를 이용한 mosaic clone 실험을 수행하였다. 흥미롭게도, rhino 돌연변이 clone은 나이가 들어감에 따라 감소하였다. 뿐만 아니라, 생식줄기세포의 유지에 중요한 JAK-STAT pathway의 핵심 요소인 STAT의 양이 rhino mutant에서 극적으로 감소한 것을 확인하였다. 결론적으로, rhino 유전자는 수컷생식줄기세포 유지에 중요한 STAT 단백질의 양을 조절하여 생식세포 항상성에 기여한다. Rhino와 STAT 사이의 분자적인 조절 기작에 대한 추후 연구가 필요하다.

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