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Title Page

Abstract

Contents

Chapter Ⅰ. Stiffened matrix promotes oral carcinogenesis via non-canonical Hedgehog signaling 19

1. Introduction 20

2. Materials and methods 24

2.1. Drugs and chemicals 24

2.2. Human subjects 24

2.3. Animal studies 25

2.4. Tissue stiffness assessment 26

2.5. Histology and immunohistochemistry (IHC) 26

2.6. Tissue microarray (TMA) analysis 27

2.7. Analysis of mouse tissue staining 28

2.8. Synthesis of methacrylated hyaluronic acid (MeHA) hydrogel 29

2.9. Cell culture 30

2.10. Cytotoxicity 31

2.11. Cell immunofluorescence staining 31

2.12. Microscopy and image evaluation 32

2.13. Proliferation assay 33

2.14. Collective migration assay 34

2.15. Transwell migration assay 34

2.16. Invasion assay 35

2.17. Reverse transcription (RT) real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) 35

2.18. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 36

2.19. Immunoblot 36

2.20. Statistical analysis 38

3. Results 39

3.1. Hedgehog signaling induced stroma remodeling and elevated matrix stiffness during chronic injury 39

3.2. Elevated matrix stiffness promotes GLI2 activation via RhoA/ROCK/p-MLC pathway 44

3.3. Mechanically activated GLI2 stimulate proliferation, epithelial-to-mesenchymal transition, migration and invasion 61

3.4. Hedgehog signaling stimulates the progression of oral epithelial dysplasia in a mouse model 64

3.5. Extracellular matrix softening by inhibiting collagen crosslinking slows the progression of OSCC in mice 67

3.6. Nuclear GLI2 positivity is closely linked with collagen accumulation in patients with OSCC 76

4. Discussion 79

5. Conclusion 84

6. References 87

Appendix 100

Chapter Ⅱ. Electrical stimulus mediates cellular mechanotransduction and epigenetic modification 101

1. Introduction 102

2. Materials and methods 104

2.1. Electrical stimulation (ES) device 104

2.2. Drugs and chemicals 104

2.3. Cell culture 105

2.4. ES optimization 105

2.5. Cell proliferation assay 106

2.6. Immunoblot 107

2.7. Secretome analysis 107

2.8. Transfection 108

2.9. Reverse transcription (RT) real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) 108

2.10. Calcium oscillation 109

2.11. RNA sequencing 110

2.12. Cell spreading area 110

2.13. Chromatin decondensation (CDC) 110

2.14. ATAC sequencing 111

2.15. Immunofluorescence staining of cells 112

2.16. Plasmid transfection 113

2.17. Analysis of histone H3 modification 113

2.18. Animal subject (Ex vivo) 114

2.19. Histology and immunostaining 114

2.20. Statistical analysis 116

3. Results 117

3.1. Temporal electrical stimulation enhances cell proliferation via secreted proteins 117

3.2. Temporal ES attenuates calcium oscillation to promote cell proliferation 130

3.3. Cell tension increase is not strongly linked with ES-mediated secretome release and proliferation enhancement. 144

3.4. ES modulates nucleus decondensation, but the nucleus membrane tension-activated Ca channel is not indispensable for ES-induced secretome 154

3.5. Globular chromatin is assessable by ES 162

3.6. ES induces the epigenetic modification and transcription factor activation 167

3.7. Ex vivo investigation confirms ES-mediated mechano and euchromatin attribute 179

4. Discussion 189

5. Conclusion 192

6. References 194

Appendix 201

국문초록 211

List of Appendix Tables

Chapter Ⅰ. Stiffened matrix promotes oral carcinogenesis via non-canonical Hedgehog signaling 14

Appendix 1. List of primer sequences used in this study. 100

Chapter Ⅱ. Electrical stimulus mediates cellular mechanotransduction and epigenetic modification 14

Appendix 1. Chemical information used in this study. 201

Appendix 2. Antibody information was used in this study. 202

Appendix 3. The sequences of primers used in this study. 203

Appendix 4. ATAC-seq quality control metrics. 205

List of Figures

Chapter Ⅰ. Stiffened matrix promotes oral carcinogenesis via non-canonical Hedgehog signaling 15

Figure 1. Hedgehog (Hh) signaling enhances matrix stiffness during chronic oral injury. 43

Figure 2. Hedgehog (Hh) signaling enhances matrix stiffness which, in turn, activates epithelial YAP and GLI2 during chronic oral injury. 46

Figure 3. Hedgehog (Hh) signaling enhances matrix stiffness which, in turn, activates epithelial YAP and GLI2 during chronic oral injury. 48

Figure 4. Synthesis of methacrylated hyaluronic acid (MeHA) hydrogels and assessment of mechanoresponsivenss in oral epithelial cells. 51

Figure 5. Elevated matrix stiffness promotes GLI2. 52

Figure 6. Oral squamous cell carcinoma (OSCC) cells lose primary cilia (PCs) on stiff matrices. 55

Figure 7. Treatment with tubacin inhibits GLI2 nuclear translocation via a decrease in filamentous actin (F-actin) while increasing ciliated cells. 57

Figure 8. Elevated matrix stiffness promotes GLI2 activation via RhoA/ROCK/p-MLC pathway-mediated actin cytoskeletal tension. 60

Figure 9. Mechanically activated GLI2 stimulates cell proliferation, migration, and invasion of OSCC cells. 62

Figure 10. Mechanically activated GLI2 promotes cell proliferation, migration, and invasion of OSCC cells. 63

Figure 11. Oral epithelial cells gain GLI2-dependent proliferative and migratory abilities throughout oral epithelial dysplasia. 66

Figure 12. Extracellular matrix (ECM) softening by inhibiting collagen crosslinking decreases collagen contents and inhibits the activation of YAP. 70

Figure 13. Extracellular matrix (ECM) softening by inhibiting collagen crosslinking decreases collagen contents and inhibits the activation of GLI2. 72

Figure 14. ECM softening slows the progression of OSCC in mice. 74

Figure 15. ECM softening slows the progression of OSCC in mice. 75

Figure 16. Nuclear GLI2 expression is closely linked with collagen accumulation in patients with OSCC. 77

Figure 17. Nuclear GLI2 expression is closely linked with collagen accumulation in patients with OSCC. 78

Figure 18. Schematic diagram of the mechanism by which stiffened matrices promote oral carcinogenesis through non-canonical Hedgehog signaling. 86

Chapter Ⅱ. Electrical stimulus mediates cellular mechanotransduction and epigenetic modification 16

Figure 1. Electrical stimulation (ES) treatment setup and modeling of ES effect in media. 118

Figure 2. Temporal electrical stimulus (ES) enhances fibroblast proliferation. 119

Figure 3. Temporal electrical stimulus (ES) accelerated the proliferation of different types of adherent cells. 121

Figure 4. Temporal electrical stimulus (ES) accelerated the cell proliferation with determined incubation conditions with different cell spreading areas. 122

Figure 5. ES enhances fibroblast cell migration. 123

Figure 6. Replacement of ES-conditioned suppressed the cell proliferation. 125

Figure 7. ES-conditioned media is key for upregulating cell proliferation. 127

Figure 8. Temporal ES enhances cell proliferation via secreted proteins. 128

Figure 9. Secreted proteins and their gene levels are different. 129

Figure 10. Go terms detected by David analysis with ES-induced 1099 DEG. 131

Figure 11. ES appears to influence the cellular calcium dynamics. 133

Figure 12. Temporal ES attenuates calcium oscillation. 136

Figure 13. ES impaired calcium oscillation of fibroblast, which is recovered by nucleus-ER ion channel or tension inhibitor. 139

Figure 14. Temporal ES attenuates calcium oscillation to promote cell proliferation. 140

Figure 15. ES-induced protein secretion triggers mechanosensitive ion channels and intracellular calcium, contributing to various cellular processes. 143

Figure 16. ES enhanced the cell tension. 145

Figure 17. ES enhances cell spreading area even in small projection cells. 147

Figure 18. Time-dependent pMLC expression during and after ES treatment. 149

Figure 19. Cell tension increase is not strongly linked with ES-mediated secretome release and proliferation enhancement. 151

Figure 20. Cell tension increase is not strongly linked with ES-mediated secretome release and proliferation enhancement. 153

Figure 21. Nucleus chromatin decondensation occurs by ES. 156

Figure 22. Calcium oscillation and EdU staining under Nucleus-ER related mechanotransduction inhibitor. 159

Figure 23. Nucleus chromatin decondensation occurs by ES but is not indispensable for ES-mediated secretome release. 161

Figure 24. Globular chromatin is assessable by ES. 164

Figure 25. Globular chromatin is assessable by ES. 166

Figure 26. ES induces H3 acetylation (H3ac). 169

Figure 27. ES modulates transcription factor activities. 172

Figure 28. The effect of various HAT or inhibitors on H3 acetylation (H3ac). 174

Figure 29. ES modulates histone acetyltransferase and histone deacetylases to enhance H3 acetylation (H3ac). 176

Figure 30. ES induces H3ac increase by histone acetyltransferase, and both H3 acetylation (H3ac) and intracellular Ca²⁺ increases are required for ES-mediated... 178

Figure 31. ES altered the cell morphology and extracellular matrix deposition, ex vivo. 181

Figure 32. ES enhances cell proliferation, tension, and migration in ex vivo. 182

Figure 33. ES induces calcium deposition and euchromatin formation in ex vivo. 183

Figure 34. ES-mediated secretome release depends on the intracellular Ca²⁺ and HAT in ex vivo. 186

Figure 35. ES-enhanced cell tension and migration diminished with intracellular calcium or histone acetyltransferase inhibition in ex vivo. 187

Figure 36. ES-enhanced cell proliferation and ion channel activation suppressed by intracellular calcium or histone acetyltransferase inhibition, ex vivo. 188

Figure 37. Mechanomechanism for ES-induced fibroblast secretome release. 193

List of Appendix Figures

Chapter Ⅱ. Electrical stimulus mediates cellular mechanotransduction and epigenetic modification 16

Appendix 5. Live and Dead images at 24 h post-ES treatment with different ES conditions. 206

Appendix 6. Go terms detected by David analysis with ES-induced 1099 DEG. 207

Appendix 7. A detailed analysis of ion channel activity by RNA sequencing. 208

Appendix 8. David analysis. 209

Appendix 9. Reactome pathway analysis using ES-induced accessible genes list. 210

초록보기

 복잡한 세포 생물학의 세계에서 세포와 주변 미세환경 사이의 역동적인 상호작용은 매우 중요한 주제입니다. 세포는 주변 환경의 기계적 단서를 감지하고 이에 반응하는 특별한 능력을 가지고 있는데, 이를 기계적 변환이라고 합니다. 세포가 물리적 환경의 변화, 특히 세포외 기질 (ECM, Extracellular matrix)의 강성 변화와 전기 자극을 어떻게 감지하고 이에 적응하는지 이해하는 것은 조직 공학, 재생 의학에서 암 연구, 신경생물학에 이르기까지 다양한 분야에서 깊은 의미를 갖습니다. 여기에서 우리는 기계적 변환이라는 흥미로운 세계와 매트릭스 강성과 전기 자극 사이의 상호 작용이 세포 행동에 어떻게 영향을 미치는지 탐구합니다. 이 연구는 기본적인 세포 내 과정에 대한 지식을 확장할 뿐만 아니라 치료 및 생체 모방 재료 설계를 위한 혁신적인 전략을 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

암 발병에 기여하는 수많은 요인 중에서 종양 미세환경이 중추적인 역할을 합니다. 이러한 미세 환경의 흥미로운 측면은 세포외 기질과 암 발생 및 진행에 대한 영향을 끼친다는 점입니다. 우리는 ECM 의 물리적 특성 변경이 어떻게 구강암의 시작과 진행을 촉진할 수 있는지에 대한 관심이 있습니다. 그렇기 때문에 이 탐구에서 물리적 특성 중 매트릭스 강성의 변화가 구강 편평세포 암종 (OSCC)의 발병에 기여하는 신호 전달 경로를 촉발할 수 있는지 이해하기 위한 연구를 진행합니다. 잘 확립된 표준 헤지호그 (hedgehog) 경로에서 벗어난 비정규 헤지호그 신호 전달 경로는 암 병인에 대한 이해를 더욱 복잡하게 만듭니다. 1 장에서 우리는 세포외 기질에서 파생된 기계적, 화학적 단서와 발암 신호 사이의 상호 작용이 암의 발달과 진행에 크게 영향을 미친다는 사실을 발견했습니다. 최근 연구에 따르면 잠재적으로 악성 종양이 발생하기 쉬운 조직과 OSCC 는 정상적인 구강 점막과 비교할 때 더 높은 강성을 보인다는 사실이 밝혀졌습니다. 그럼에도 불구하고, 증가된 세포외 기질 강성이 구강 편평 세포 암종에서 종양 성장을 촉진하는 정확한 메커니즘은 여전히 수수께끼로 남아 있습니다. 구강 편평 세포 암종에서 세포외 기질 강성의 전종양 유발 영향을 밝히기 위한 탐구에서 우리는 병리학적으로 관련된 강성을 모방하도록 설계된 하이드로겔과 함께 만성 구강 손상과 관련된 마우스 모델을 사용했습니다. 우리의 연구를 통해 전암 단계에서 기계적 반응 신호가 전달되는 상피 세포와 섬유아세포 사이의 동적 교환이 밝혀졌습니다. 구체적으로, 상피 세포는 섬유아세포를 활성화하여 세포외 기질 단백질과 세포외 기질 리모델링을 담당하는 효소를 생성하는 Sonic 헤지호그를 방출하여 세포외 기질 경화를 유도합니다. 결과적으로, 이 강화된 세포외 기질에 인접한 기저 상피 세포는 증가된 증식을 나타내고 상피에서 중간엽으로의 전환을 겪어 강화된 이동성 및 침습적 특성을 얻습니다. 이는 차례로 침습성 구강 편평 세포 암종의 성장을 촉진합니다. 특히, 우리는 액틴 세포골격 장력에 의해 활성화되는 발암성 GLI2 가 전사체 수준에서 이 과정을 지배한다는 것을 정확히 지적했습니다. 더욱이, 우리의 연구는 세포외 기질의 경화에 관여하는 효소인 리실 산화효소를 억제함으로써 OSCC 의 진행을 늦추는 가능성을 보여주었습니다. 이러한 발견은 특히 구강 편평세포 암종와 관련하여 GLI2 를 활성화하는 비정규 경로를 해결함으로써 발암성 헤지호그 신호 전달을 방해하는 전략으로 세포외 기질 강성을 표적으로 삼는 잠재적 효능을 강조합니다.

기계적 변환과 후성유전학적 변형 과정은 세포 기능의 기본 측면으로 인식되어 왔지만, 이들의 상호 작용이 심오한 과학적 발견의 원천이라는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다. 이러한 복잡한 과정의 결합에는 역학과 후생유전학의 영역을 연결할 수 있는 잠재력을 지닌 역동적인 힘인 전기자극이 있습니다. 따라서 우리는 기계적 단서, 전기 신호 및 세포 내 후생적 변화의 놀라운 세계 사이의 얽힌 관계를 탐구했습니다. 이번 조사는 세포가 전기 신호 전송을 통해 물리적 주변 환경을 어떻게 감지하고 반응하는지, 그리고 이러한 반응이 어떻게 유전자 발현과 세포 행동의 지속적인 변화로 나타날 수 있는지에 대한 더 깊은 이해를 밝힐 준비가 되어 있습니다. 2 장에서는 세포가 생물물리학적 자극을 인지하고 이를 생화학적 신호로 변환하며 후생적 변형을 통해 행동을 조정하는 놀라운 능력을 가지고 있음을 설명합니다. 임상 및 생물의학 응용 분야에서 재생 도구로서 전기 자극 (Electric stimulus)에 대한 광범위한 사용과 관심 증가에도 불구하고 ES 가 기계적 전달 경로를 통해 세포 행동에 영향을 미치는 정확한 메커니즘은 여전히 부적절하게 이해되고 있습니다. 여기에서 우리는 시간에 따른 전기 자극이 주로 저장된 분비물의 방출을 촉진하고 기계적 변환 기계를 포함함으로써 세포 역학을 크게 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 우리는 전기 자극이 세포 내 칼슘 수준, 세포질 및 핵 장력의 조정, 기계적 변환기의 핵으로의 전위, 염색질의 탈축합을 포함하여 중요한 기계 민감성 사건을 효과적으로 조절하여 히스톤 3 아세틸화를 증가시키는 것을 관찰했습니다. ATAC 시퀀싱 데이터에 대한 우리의 분석에 따르면 일시적인 ES 에 노출된 세포는 세포 증식 인자의 전사, 세포외유출 및 기계적 민감성 칼슘 채널과 같은 세포 역학과 관련된 필수 생물학적 기능에 대해 더 큰 염색질 접근성을 나타냈습니다. 광범위한 억제제 연구를 통해 우리는 세포 내 칼슘 흡수와 히스톤 3 아세틸화의 증가가 전기자극 유발 분비물 방출의 중추적인 요인임을 제안했습니다. 이 발견은 칼슘 방출 나노입자와 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 활성화제를 포함하는 개념 증명 실험을 통해 전기 자극 유도 분비물 방출과 그에 따른 세포 증식을 시뮬레이션함으로써 더욱 검증되었습니다. 추가적으로, 전기자극으로 처리된 생체외 피부 샘플에 대한 실험은 세포내 칼슘 진동 및 유염색질 상태를 변경함으로써 세크톰의 방출 증가를 확증했습니다. 우리의 연구는 특히 세포내 칼슘 진동 및 후생적 변화와 관련하여 신중하게 시기를 맞춘 외부 ES 와 기계적 변환 기계 사이의 강력한 연결을 강조합니다. 이러한 발견은 임상적 맥락에서 ES 치료의 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해를 심화시킵니다.

함께, 이 연구는 구강 발암의 복잡한 웹에서 기질 강화와 비정규 헤지호그 신호 전달 경로의 역할을 궁극적으로 밝혀내고 암 예방 및 치료에 대한 혁신적인 접근 방식을 마련하여 질병의 영향을 받는 사람들에게 희망을 제공했습니다. 또한, 우리는 세포의 기계적 변환, 후성유전학적 조절, 세포의 운명을 결정하는 전기 신호의 중추적인 역할을 풀어냈습니다. 마지막으로, 우리는 생물학과 의학의 가장 심오한 질문을 해결하기 위해 이러한 프로세스를 이해하고 활용하기 위한 혁신적인 경로를 열 수 있습니다. 따라서 이 논문은 세포의 기계적 반응, 매트릭스 강성 변조 및 전기적 조절의 복잡한 상호작용을 풀어 궁극적으로 세포가 끊임없이 변화하는 물리적 환경을 인식하고 적응하는 방법에 대한 비밀을 밝히는 데 더 가까워졌습니다.

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