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Title Page

국문 초록

Abstract

Contents

Ⅰ. Introduction 14

1. The important of ICD in overcoming the limitations of cancer immunotherapy 14

2. Mechanisms by which ICDs promote the immunogenicity of tumors 17

3. Advanced HTS system needed for ICD inducer screening 20

4. Image-based AI analysis: the key to develop HTS for ICD inducer 20

Ⅱ. Materials and Methods 24

1. Cell lines and culture 24

2. Reagents and antibodies 24

2.1. Reagents 24

2.2. Antibodies and fluorescent labelling probes 25

3. Crystal violet assay 26

4. Caspase 3/7 activity live imaging 26

5. Western blotting 27

6. LDH assay 28

7. Silver staining 28

8. Calreticulin IF staining 29

9. Extracellular ATP assay 30

10. Bone marrow-derived immune cells culture 30

11. Phagocytosis 31

12. Statistical analysis 31

Ⅲ. Results 32

1. Development of the AI ICD-HTS system through pseudo-labeling 32

2. Blinded testing of unknown compounds using real-time AI imaging analysis 35

3. Exclusion of apoptosis inducers from candidates 41

4. Confirmation of membrane rupture and release of internal materials by the selected candidates 45

5. Verification of DAMPs release by the selected candidates 47

6. Validation of antigen-presenting cell activation by the selected candidates 49

7. Cross-checking reported information about candidates with experimental results 51

Ⅳ. Discussion 54

Ⅴ. References 58

List of Tables

Table 1. Cross-checking reported information about candidates with experimental results. 53

List of Figures

Figure 1. Development of the AI ICD-HTS system through pseudo-labeling. 34

Figure 2A. Blinded testing of unknown compounds using real-time AI imaging analysis. 37

Figure 2B. Blinded testing of unknown compounds using real-time AI imaging analysis. 38

Figure 2C. Blinded testing of unknown compounds using real-time AI imaging analysis. 39

Figure 2D. Blinded testing of unknown compounds using real-time AI imaging analysis. 40

Figure 3A. Exclusion of apoptosis inducers from candidates. 43

Figure 3B. Exclusion of apoptosis inducers from candidates. 44

Figure 4. Confirmation of membrane rupture and release of internal materials by the selected candidates. 46

Figure 5. Verification of DAMPs release by the selected candidates. 48

Figure 6. Validation of antigen-presenting cell activation by the selected candidates. 50

List of Schemes

Scheme 1. A schematic diagram of the molecular mechanisms of ICDs. 16

Scheme 2. A schematic diagram of the roles of DAMPs in ICD. 19

Scheme 3. A schematic figure of the overall AI based ICD-HTS system. 23

초록보기

 현재 FDA에서 승인된 면역항암제들은 높은 치료 효과와 낮은 부작용으로 주목받고 있지만, 고액의 치료비와 일부 암에서만 효과를 가지는 문제점을 가진다. 최근 면역항암제의 치료효과와 적용대상 확대를 위해 면역 반응성이 낮은 cold tumor에 면역원성을 부여하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 면역원성 세포사멸(Immunogenic cell death: ICD)을 유발하여 cold tumor를 hot tumor로 전환하는 시도가 주목받고 있다. ICD는 세포막 붕괴로 인해 세포가 부풀어 오르고(cell swelling) DAMPs가 방출되는 특징이 있기 때문에, ICD 유도 물질을 선별하기 위해서는 세포막의 형태학적 변화와 DAMPs의 시공간적 변화를 종합적으로 판단할 이유가 있다. 따라서 성공적인 ICD 유도물질 스크리닝을 위해서는 DAMPs를 표적 하는 다중 형광 마커와 실시간 이미지를 기반으로 하는 복합적인 분석이 요구된다. 그러나 이러한 분석 방식은 많은 시간과 노력이 요구되므로 대량의 복잡한 이미지 데이터를 신속하고 정확하게 처리할 수 있는 진보된 분석 시스템의 개발이 필요하다.

본 연구에서는 용해성 세포사의 형태학적 특징을 인식하는 AI 알고리즘을 개발하고 이를 탑재하여 광학 이미지만으로 높은 정확도로 ICD 후보물질의 신속한 선별이 가능한 HTS 시스템을 구축하였다. AI machine learning을 위해 ICD로 사멸하는 세포를 형태학적 특징에 따라 swelling cell (S.C)과 dead cell (D.C)로 구분해 학습 자료를 제공했으며, labeling이 지정되지 않은 세포의 DIC 이미지를 이용하여 해당 AI 시스템의 정확도를 평가하였다. 이후 실시간 이미징 장비에 탑재된 AI 시스템에 대한 블라인드 테스트가 진행되었으며, AI는 S.C population 비율 기반으로 10가지 물질 중 ICD 유도물질을 예측하였다. AI가 분류한 후보물질들을 검증하기 위해 먼저 apoptosis probe를 이용하여 apoptosis 유발물질을 배제하였고, 이후 DAMPs의 방출 여부와 이로 인한 항원제시세포의 활성화를 확인하였다. 결과적으로 언급한 in vitro 검증을 통해 AI가 예측한 후보물질들이 실제 ICD 유발 물질들임을 확인할 수 있었다.

이 AI 기반 ICD-HTS 시스템은 약물 스크리닝에 소요되는 시간과 비용을 획기적으로 줄일 수 있으며, 약물 검증을 위한 실험 조건 설정에도 용이하다. 따라서 이번 연구를 통해 개발된 광학 이미지 기반 세포 판별 인공지능은 ICD 예측을 넘어 다양한 기초 연구 및 약물 스크리닝에 활용되어 효과적인 치료제 개발을 가속화할 것으로 기대된다.

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