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표제지

ABSTRACT

목차

List of Abbreviations 10

Ⅰ. 서론 11

Ⅱ. 재료 및 방법 15

1) 실험재료 및 재배방법 15

2) 교배후대 분리 집단 육성 15

3) Total RNA 추출 및 PCR 분석 15

4) 가루이접종 및 접목 16

5) ToCV 저항성 유전자의 유전분석 16

6) RNA-sequencing분석 17

7) RT-qPCR 분석 18

Ⅲ. 결과 및 고찰 19

1) ToCV 감염여부 확인마커개발 19

2) 온실가루이 접종 및 접목에 의한 저항성 개체 검정 21

3) RNA-sequencing에 의한 putative ToCV 저항성 유전자 동정 및 발현분석 27

Ⅳ. 결론 40

참고문헌 42

국문요약 52

표목차

Table 1. Genetic separation of ToCV resistant genes in F₂ populations. 26

Table 2. Top 20 genes with high expression in ToCV resistant leaves (yellow) 32

Table 3. Top 20 genes with low expression in ToCV resistant leaves (yellow). 34

Table 4. List of DE (Iog2-fold＞2.0, FPKM＞100) defense-related genes most highly regulated in ToCV resistant tomato and susceptible systems 36

Table 5. Comparison of transcriptional changes detected by RNA-Seq and qPCR 38

그림목차

Figure 1. Geographical distribution of tomato chlorosis virus. Countries and territories where the virus have been found are in blue. 13

Figure 2. ToCV genomic organization. The boxes represent open reading frames (ORFs). Acronyms: Pro, Proteinase; MTase, Methyltransferase; Hel, Helicase; RdRp, RNA dependent RNA polymerase;... 14

Figure 3. (A) ToCV resistant line and virus-derived DNA amplification primer set. (B) Detection of infected plants through RT-PCR analysis. 20

Figure 4. Detection of ToCV infection using leaves collected from breeding packages at the Tomato Life Sciences Research Institute. 22

Figure 5. ToCV-derived infection through tomato grafting experiment using leaf organ. 23

Figure 6. The phenotype of resistant and sensitive leaves through grafting experiments in greenhouses 24

Figure 7. RT-PCR analysis using the top leaf after grafting in the F₂ populations. 25

Figure 8. Number of genes that are upregulated and downregulated as a result of RNA-sequencing of ToCV-resistant and susceptible individuals. 29

Figure 9. Gene expression profile of ToCV resistance and susceptible leaves. Genetic expression is indicated by Reads per kilobase per million mapped reads (RPKM), red shows high expression in... 30

Figure 10. Expression profile of electron transport system-related genes in resistant and susceptible leaves. 31

Figure 11. Comparison of transcriptional changes detected by RNA-Seq and qPCR. 39

초록보기

 Tomato chlorosis virus (ToCV)는 전형적인 crinivirus (Family Closteroviridae)로 양성 단일 가닥 RNA의 2 부분 게놈이 800-850 nm의 유연한 비리온으로 캡슐화되어있다. 최근까지 ToCV는 전 세계 39개 국가와 지역에서 감염된 것으로 알려졌다. 토마토가 ToCV에 감염되면 엽록소 부족으로 광합성을 하지 못해 토마토 생산에 커다란 타격을 받는다. 본 연구에서는 토마토 ToCV 저항성 유전자의 동정을 위한 기초적인 지식을 얻기 위해, ToCV 게놈 유래 특이적으로 증폭할수 있는 primer개발과 저항성 및 감수성계통간의 교배 후대의 bulk 집단을 이용하여RNA-sequencing 및 qRT-PCR 분석 등을 수행하였다. 본 연구의 결과를 요약하면 다음과 같다.

1. ToCV genome의 구조 분석 결과, CP 영역에서 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트(Fw1, 5'-GT GTCAGGCCATTGTAAACCAAAG-3' Rv1, 5'-CACAAAGCGTTTCTTTTC ATAAGCAGG-3')를 선별하였다. RT-PCR 분석 결과, ToCV 감염 조직에서는 밴드가 증폭되었으나 정상 조직에서는 증폭되지 않았다. 따라서 Fw1/Rv1 프라이머 세트는 ToCV 감염을 확인하는 분자 마커로 사용될 수 있습니다.

2. 비닐온실에서 자연적으로 흰파리를 접종한 토마토 중 황백엽을 보이는 9개 식물에서 ToCV 감염 여부를 조사하였다. 그 결과, ToCV 특이적인 밴드는 2개의 식물체에서만 나타났고, 이들 식물체 유래 조직을 이용하여 접목 실험을 수행하였다.

3. ToCV 내성 균주와 감수성 균주를 교배하여 얻은 F₂ 세대 30 개체에 ToCV 감염 조직을 이식하였다. 그 결과 1, 2, 6, 10, 17, 29번 식물등 총 6개체는 저항성을 보였으나 나머지 24개 식물은 감수성을 보였다. 감수성을 보인 식물의 잎에서 백화 현상은 생육 후기에 더욱 두드러졌다. 그러나 저항성 식물은 정상적인 엽록소 조직을 유지했습니다.

4. ToCV 저항성 유전자의 유전성을 알아보기 위해 X² test를 진행한 결과, 멘델의 법칙에 따라 단일 열성 유전자에 의해 유전됨을 확인하였다.

5. RNA 염기서열 분석 결과, 두 검체 사이에서 상향 조절된 유전자의 수는 감수성 61개, 저항성 456개였다. 그리고 발현된 유전자는 두 그룹 모두에서 발현된 수는 93개였다. 또한 하향조절된 유전자의 수는 감수성 개체에서 67개 유전자, 저항성 개체에서 353개 유전자로 확인되었다. 그리고 두 그룹에서 발현된 유전자의 수는 240개였다.

6. GO 분석 결과, 감수성 잎에서 발현량이 높은 유전자는 ATP 합성과 관련된 ATP 합성 결합 전자 수송, 세포 호흡, ATP 합성 결합 양성자 수송, NADH 탈수소효소 (ubiquinone) 활성 및 양성자 수송 ATP 합성효소 복합체를 포함한다. 등이 존재했습니다. 저항성 벌크와 감수성 벌크 사이에서 발현 수준의 차이가 큰 상위 20개 유전자는 질병 관련 단백질, 노화 관련 단백질 및 전자 조절 단백질과 관련이 있었습니다. 발현량의 차이가 적은 하위 20개 유전자에서는 엽록소 결핍 단백질, 광합성 관련 단백질 등 광손상 관련 단백질이 검출되었다.

7. ToCV 저항성 유전자 탐색을 위해 RNA-sequencing 분석 데이터를 기반으로 후보 유전자 25개를 선정하였다. 저항성 식물에서 선택된 25개 유전자의 발현 수준을 결정하기 위해 RT-qPCR을 수행하였다. 그 결과 25개 유전자 모두 저항성 식물체에서 높은 발현 양상을 보였으며, ToCV 저항성 유전자는 글리코실 가수분해효소와 관련이 있었다.

이상의 결과를 바탕으로 ToCV 게놈 정보를 이용하여 ToCV 감염 여부를 확인할 수 있는 분자 마커를 개발하였고, F₂ 분리군에서 ToCV 내성 유전자의 유전성을 확인하였다. 그리 고 RNA-sequencing 분석을 통해 ToCV 저항성 유전자로서 glycosyl hydrolase를 최종 예비후보로 선정하였다. 따라서 향후 글리코실 가수분해효소 유전자의 기능을 더욱 규명하여 분자육종용 분자표지자 개발 및 형질전환체 육종에 활용하고자 한다.

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