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Title Page

Contents

Abbreviations 9

ABSTRACT 10

국문 초록 13

Introduction 16

Materials and Methods 20

1. Cell Cultures 20

2. Tumor models in vivo 20

3. Tumor growth and measurement 21

4. In vivo Irradiation 21

5. IFN-γ ELISpot assay 22

6. Flow Cytometry 22

7. Lung metastasis 24

8. Statistical analysis 25

Results 29

3.1. The combined treatment of PLAG and Radiation RT delayed the tumor progression in preclinical tumor models. 29

3.2. PLAG administration maintained metastatic stability without adverse effects on body weight and lung metastasis. 31

3.3. Augmented tumor-specific IFN-γ response confirmed that immune is a key factor in boosting therapeutic effect of PLAG and RT. 34

3.4. The combined treatment of PLAG and RT increased M1 macrophages and Dendritic cells in CT-26 mice. 36

3.5. M1 macrophages and Dendritic cells in CT-26 mice tend to increase in the combination treatment of RT + PLAG. 38

3.6. The combined treatment of PLAG and RT decreased M2 macrophages and Treg cells in CT-26 mice. 41

3.7. The decreased level of iNOS levels may contribute in boosting effect of PLAG and RT despite of the elevated MDSC counts. 43

Discussion 46

References 51

List of Figures

Figure 1. Treatment scheme of the study. 26

Figure 2. Flow cytometry gating strategies for CD8⁺ T cells and macrophage. 27

Figure 3. Flow cytometry gating strategies for Tregs and MDSCs. 28

Figure 4. The combination of RT and PLAG effectively delayed tumor growth in FSaII and CT-26 bearing mice, but not in CT-26 bearing nude mice. 30

Figure 5. Effect of PLAG on mice body weight and lung metastasis legion measurements throughout the study in BALB/c, BALB/c-nude, and FSaII mice. 33

Figure 6. The combination of RT and PLAG increased tumor specific IFN-γ secretion on day 10 and 15 in CT-26 mice 35

Figure 7. The increased activation of CD8⁺ T cell plays a key role in enhancing the combination effect. 37

Figure 8. Changes in M1 macrophages and DC cells when combining RT and PLAG in CT-26 bearing mice. 40

Figure 9. Changes in M2 macrophages and Treg cells when combining RT and PLAG in CT-26 bearing mice. 42

Figure 10. The decreased level of iNOS level in MDSC on Day 10 plays a key role in enhancing the combination effect. 45

초록보기

 지속된 항암 연구의 기초 아래, 면역 체계를 타겟으로 악성 종양을 치료하는 방법이 새로운 패러다임으로 대두되었다. 이러한 면역 항암 요법은 종양을 직접적으로 공격하거나 주변 세포를 타겟으로 하는 1세대, 2세대의 화학 항암제들이 가지고 있던 정상세포의 사멸과 약제 내성 등의 부작용을 줄이는 동시에, 환자가 체내에 가지고 있는 면역세포를 증진시킴으로써 부작용없이 지속적인 치료가 가능한 방법으로 받아들여진다. 추가적으로, 방사선 치료요법 또한 일반적으로 널리 사용되고 있는 종양 치료법의 한 종류이다. 50% 이상의 암환자들이 이러한 방사선 치료를 받는 추세인데, 최근에는 이러한 방사선 요법이 항종양 면역반응을 유도한다는 결과가 여러 연구를 통해 밝혀지고 있다. 이와 같은 배경을 바탕으로, 본 연구는 정밀 고선량 방사선 치료 (SABR)와 녹용에서 유래한 면역 조절제인 PLAG (EC-18) 를 병용치료 했을 때의 효과에 초점을 맞추고 있다. 따라서 본 연구의 목적은 첫째, 방사선 치료와 PLAG 를 병용치료 하였을 때 면역세포의 증진을 통한 항암효과가 관찰되는지, 둘째, 종양 안에서 어떠한 면역세포들의 변화가 관찰되었는지를 확인하는 것이다.

먼저, 본 연구에 사용된 마우스 종양 모델은 CT-26 가 이식된 BALB/c 마우스와 BALB/c-nude, 그리고 FSaII 섬유육종세포가 이식된 C3H 마우스이다. 각각의 암세포는 마우스의 오른쪽 허벅지에 2.0 x 105 개씩 피하 주사하였다. 마우스는 종양을 이식한 후 10 일 후에 7 Gy 의 방사선을 이틀간 조사받았고, 방사선 조사 시점부터 250 mg/kg 의 PLAG 도 매일 경구 투여하는 방식으로 진행되었다. 이 병용치료의 효과는 시간에 따른 종양의 크기를 비교하는 그래프와, 체중, 폐 전이 관찰, ELISpot 분석 및 유세포 분석을 통한 직접적인 면역세포를 비교하는 과정을 통해 확인하였다. 먼저 종양 성장 그래프를 통해서 방사선과 PLAG 를 병용치료한 그룹의 종양 크기가 현저하게 억제되는 것을 관찰하였고, 또한 면역이 결핍된 BALB/c-nude 마우스에서는 그 효과가 사라지는 것으로 보아, 병용치료의 항암 효과가 면역에 관련되어 있음을 확인하였다. 그리고 각각의 마우스 모델 그룹의 무게를 비교해보았을 때 통계적으로 유의미한 변화가 관찰되지 않는 것이 이 약물의 안전성과 큰 부작용이 없음을 시사하였다. 선행연구를 통해 PLAG 약물이 폐 전이를 줄이는 것에 효과가 있는 것으로도 밝혀져서 실험을 진행하였으나, 폐 전이에는 유의미한 변화를 보여주지 못했다. 추가적으로, CT-26 마우스 모델에서는 방사선을 조사한 후, 각각 5, 10, 15 일에 ELISpot 분석과 유세포 분석을 진행하였는데, 10 일과 15 일에 종양 항원 특이적인 IFN-γ 항체의 분비가 증가하는 것으로 나타났다. 이 외에도 면역을 증진시키는 것으로 알려진 CD8+ T 세포와 TNF-α 의 증가, M1 대식세포 와 DC 세포의 증가가 관찰되었으며, 반대로 면역을 억제하는 세포인 M2 대식세포 와 Treg 세포는 감소하는 경향을 보였다. 흥미롭게도 MDSC 의 개수는 증가하였는데, 그럼에도 불구하고 종양의 성장이 억제된 것은 MDSC 의 활성도를 나타내는 마커인 iNOS 의 레벨이 감소한 결과로 해석되었다.

결론적으로, 본 연구는 SABR 과 PLAG 의 병용치료가 종양안에 있는 면역 세포들을 재구성함으로써 항암효과를 촉진시킬 수 있다는 것을 시사하였고, 특히 IFN-γ 의 증가는 면역이 본 치료 방법의 핵심적인 요소임을 확인시켜주었다. 이러한 발견은 새로운 약물의 가능성을 제시하였으며, 앞으로 다양한 암 종에 대한 병용치료 접근과 메커니즘을 밝히는 연구가 추가적으로 이루어질 것으로 생각된다.

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