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표제지
제출문
Summary
요약문
목차
제1장 서론 17
제2장 재료 및 방법 21
제1절 실험재료 21
1. 사용 균주 21
2. 사용 배지 22
3. 산업용 발효 원료 24
4. 시약 및 효소 25
제2절 실험방법 26
1. 전분질 기질의 전처리 26
2. 산업용 발효기질의 전처리 26
3. 발효율의 측정 27
1) Flask scale에서의 알코올 발효 27
2) Jar-fermentor scale에서의 알코올 발효 27
4. 변온발효 (temperature gradient fermentation) 28
5. 알코올 농도, 당분석 및 효소역가 측정 28
6. 영양 요구주의 분리 28
7. 원형질체 융합 30
1) 원형질체 형성과 재생 30
2) 원형질체 융합 31
3) 융합균주의 유전적 안정성 32
8. 분리 균주의 동정 32
9. 종균 배양 33
10. 균의 생육도 측정 33
11. SDS-polyacrylamide 전기 영동 33
12. Fatty Acid Methyl Esters(FAMEs) Analysis 34
13. Western blotting Analysis of HSP104 35
14. Death Kinetics Analysis 39
15. Differential Scanning Calorimeter Analysis 40
16. Fluorescense polarization measurements 41
17. TEM(Transmission Electron Microscope) Analysis 42
제3장 결과 및 고찰 43
제1절 신규 고온성 효모균주의 분리 및 알코올 발효 특성 43
1. 사용균주의 분리 및 동정 43
2. 분리균주의 내당성 47
3. 분리균주의 내알코올성 49
4. 온도의 영향 51
5. 당 농도의 영향 54
6. 질소원의 영향 60
7. Yeast extract의 영향 63
8. 초기 pH의 영향 65
9. 교반 효과 66
10. Seed volume의 영향 69
11. Antifoamer의 영향 71
12. Jar fermentor에서의 발효 73
제2절 산업기질을 이용한 여러 효모의 알코올 발효능 조사 78
1. 5 Litre Jar fermentor scale에서의 알코올 발효 78
1) 타피오카 기질을 이용한 알코올 발효 78
2) 혼합기질을 이용한 알코올 발효 79
제3절 원형질체 융합을 통한 고온 효모의 알콜 발효능 개량 81
제4절 고온발효능을 가진 효모의 고온내성에 대한 연구 83
1. FAMEs Analysis (Fatty acid methyl esters analysis) 83
2. Death Kinetics Analysis 92
3. Differential Scanning Calorimeter Analysis 98
4. Fluorospectrometric Analysis 102
5. TEM(Transmission electron microscope) Analysis 103
제5절／제6절 일산실업(주) 부산주정공장에서의 S. cerevisiae RA-74-2 균주의 현장 적용 실험 104
제4장 결론 134
참고문헌 139
[위탁연구과제결과보고서] 153
제출문 154
요약문 155
SUMMARY 158
목차 161
제1장 서론 167
제1절 연구배경 167
제2절 주요 연구 목표(당해년도) 168
제2장 실험 재료 및 방법 171
제1절 고농도 기질 및 고온발효 171
1. 균주 171
2. 발효배지 및 발효 171
가. 타피오카 전처리 171
나. 주모배지 및 배양 172
다. 발효배지 및 발효 172
3. 발효 분석 173
가. 숙성용량 173
나. 당도(Brix) 173
다. 산도(Acidity) 173
라. RDS(Residual direct sugar) 173
마. RTS(Residual total sugar) 174
바. T.S.(Total sugar) 174
사. 에탄올 174
아. 전분가 174
자. 발효비 174
차. 수율 175
카. 생존능 측정 175
제2절 고온 내성 증진 176
1. 균주 176
2. 균주선별 176
3. UV와 NTG처리 178
제3절 타피오카 발효액에 섬유소 분해 효소 첨가의 영향 178
제4절 원형질체 융합에 의한 균주개발 178
1. 균주 178
2. 배지 및 배양 179
3. 선별표지의 도입 179
4. 삼투 안정제 및 세포벽 분해 효소의 제조 180
5. 원형질체 형성 180
6. PEG 용액의 조성 181
7. 원형질체 융합 181
8. 융합주의 특성 조사 181
가. 질소원 이용 182
나. Carbon assimilation test 182
다. Cycloheximide 내성 조사 182
제5절 섬유소분해효소를 분비하는 효모형질전환체의 개발 183
1. β-Endoglucanase 유전자의 효모로의 도입 183
가. 균주 및 plasmid 183
나. 배지 및 배양 183
다. 효모 형질 전환 183
라. 형질 전환체의 선별 186
2. PCR에의한 β-endoglucanase 유전자의 random mutagenesis 186
3. Mutator E. coli를 이용한 β-Endoglucanase 유전자의 돌연변이 187
가. 균주 187
나. 배지 및 배양 188
다. 돌연변이 188
라. Mutator XL1-Red E.coli로부터 plasmid 추출 188
마. 효모로의 plasmid의 도입 189
바. 효모 형질 전환체로부터의 plasmid 추출 189
4. Endoglucanase activity 측정 190
가. 균주 190
나. 배지 및 배양 190
다. Activity 측정 190
제6절 Aureobasidin 선별표지를 이용한 균주개발 191
1. 균주 및 plasmid 191
2. 배지 및 배양 191
3. 효모형질전환 192
4. 효모형질전환체의 선별 192
5. 형질전환체의 호흡결여 돌연변이주 193
6. 형질전환체의 발효력시험 193
7. 효모로부터 plasmid추출 194
8. E. coli 형질전환 194
9. E. coli로부터 plasmid추출 194
10. 원형질체 융합 및 Rare-mating 195
제3장 결과 및 고찰 196
제1절 고농도 에탄올 생산 시험 및 균주선별 196
1. 고농도 타피오카 기질에서의 균주선별 196
2. 타피오카와 쌀보리 혼합기질에서의 균주선별 196
제2절 중고온 내성균주 개발 208
1. UV와 NTG처리에 의한 열 내성의 증진 208
2. 중고온 내성균주의 선별 212
제3절 섬유소분해효소분비 효모균주의 개발 217
1. 타피오카 발효에 섬유소 분해 효소 첨가의 영향 217
2. 원형질체 융합 229
가. Lyticase 처리 농도 및 시간의 최적화 229
나. 원형질체 융합 229
다. 융합주의 생리적 특성 232
3. Endoglucanase를 분비하는 형질전환체의 획득 232
가. 형질전환 232
나. Endoglucanase 분비 확인 234
4. PCR을 통한 endoglucanase 유전자의 random mutation 234
5. Mutator E. coli를 이용한 endoglucanase 유전자의 "in vivo" 돌연변이[원문불량;p.236] 238
6. 돌연변이된 endoglucanase의 activity 측정 240
가. 효소 반응 조건 240
나. YPGE에서 endoglucanase activity 측정[원문불량;p.238] 240
다. 효모 형질전환체로부터 plasmid 추출 및 확인 244
제4절 Aureobasidin 선별표지를 이용한 균주개발 244
1. Aureobasidin 선별표지를 이용하기 위한 최적농도 결정 244
2. 효모형질전환체의 선별 246
3. 형질전환체의 호흡결여돌연변이주의 선별 및 발효력시험 248
4. 형질전환체의 확인 248
5. Aureobasidin A 선별 표지를 이용한 원형질체 융합과 rare-mating. 252
제4장／IV. 결론 254
참고문헌 256
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원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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