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목차
[표제지 등]=0,1,2
최종보고서=0,3,1
제출문=1,4,1
요약문[파오손면;p.11]=2,5,11
목차=13,16,5
제1장 서론=18,21,1
제1절 연구개발 목적 및 범위=18,21,1
1. 연구개발의 목적=18,21,2
2. 연구개발의 내용=19,22,1
가) PCR방법에 의한 Listeria 신속검출법의 개발=19,22,1
나) PCR방법에 의한 Listeria 확정검사법의 개발=19,22,1
다) 재조합 DNA방법에 의한 Listeria 특이항원단백질의 생산=19,22,1
라) Listeria효소면역검사법을 위한 polyclonal 항체의 생산=19,22,2
마) Listeria효소면역검사법을 위한 monoclonal 항체의 생산=20,23,1
바) Listeria효소면역검사법에 의한 실험실적 검사법의 개발=20,23,1
사) Listeria효소면역검사법에 의한 야외간이 검사법의 개발=20,23,1
아) Liateria 분리동정에서 공인 표준검사법 및 수입 검출키트들과 개발된 신속검출법의 비교실험=20,23,1
제2절 연구개발 배경=21,24,1
1. 리스테리아 검색의 기술적 측면=21,24,6
2. 리스테리아 검색의 경제ㆍ산업적 측면=26,29,2
3. 리스데리아 검색의 사회ㆍ문화적측면=27,30,2
제3절 국내외 리스테리아 검색키트들=29,32,1
1. 국내외 리스테리아 검색기술의 수준=29,32,3
2. 앞으로의 전망=31,34,2
제2장 Listeria spp. PCR 검출 kit=33,36,1
제1절 서설=33,36,1
제2절 Listeria PCR 검출 kit의 제조=33,36,1
1. 공시균주=33,36,2
2. oligonucleotide primers=34,37,2
3. Listeria Multiplex PCR의 표준균주에서의 효율성 확인=36,39,2
4. L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri의 검출을 위한 SlW III Multiplex PCR=37,40,2
5. Gradient PCR을 이용한 L.ivanovii의 최적 검출 조건 검사=38,41,2
6. Listerisa Multiplex PCR 반응을 위한 Chromosomal DNA isolation Method 비교=40,43,3
7. 식품에 대한 multiplex PCR 검출법의 효율성 검사=42,45,2
8. 우유에서의 PCR 검출법=43,46,1
가. 우유에서의 PCR 검출 효율성 검사=43,46,2
나. 우유로부터 원심분리 rpm에 따른 L. monocytogenesis의 회수율 검사=44,47,2
다. 우유에서 L. monocytogenes의 균수에 따른 PCR 반응 검출의 한계=45,48,2
라. PCR 표준 반응조건=46,49,1
제3장 Listeria spp. 항원 생산=47,50,1
제1절 서설=47,50,2
제2절 Listeria spp. 재조합 p60 단백질 항원 생산=48,51,1
1. p60단백질 유전자 클로닝=48,51,1
가. Listeria spp. 균주의 배양 및 genomic DNA 순수분리=48,51,2
나. iap gene PCR 증폭 및 T-vector cloning=49,52,2
다. pMAL-c2 발현 vector에 subcloning=51,54,4
2. Listeria spp. 재조합 p60 단백질의 발현=54,57,1
가. 재조합 p60 단백질 발현조건 비교=54,57,1
1) MBP-p60/mono의 발현=54,57,1
가) IPTG 농도에 따른 MBP-p60/mono의 발현 조건비교=54,57,2
나) Induction 시간에 따른 MBP-p60/mono의 발현 조건=55,58,2
2) MBP-p60/grayi의 발현=56,59,3
3) 그 밖의 Listeria p60 재조합 단백질의 발현=58,61,4
3. 재조합 p60 단백질 대량생산 및 정제=61,64,1
가. 재조합 DNA로부터 얻어진 MBP-p60/mono와 MBP-p60/iva 단백질의 정제=61,64,2
나. 재조합 DNA로부터 얻어진 MBP-p60/grayi 단백질의 정제=62,65,2
4. 단백질 농축=64,67,1
5. 세포외 단백질 농축=64,67,1
제3절 Listeria Flagella 항원생산=64,67,1
1. 배양=64,67,2
2. 편모분리=65,68,1
3. 항원의 확인=65,68,1
가. SDS-PAGE=65,68,1
1) flagella의 SDS-PAGE=65,68,2
나. flagella의 발현=66,69,1
1) SEM(Scanning Electron Microscope)=66,69,2
2) TEM(Transmission Electron Microscope)=68,71,1
가) 초원심분리를 이용한 flagella의 정제=68,71,1
제4장 Listeria 항체 생산 및 ELISA, Rapid Kit 제작=69,72,1
제1절 서설=69,72,2
제2절 Lsteria monocytoenes anti-p60 단일클론 항체 제작=70,73,1
1. Listeria monocytoenes anti-p60 단일클론 항체 제작=70,73,1
가. Listeria monocytogenes 재조합 p60 항원 단백질 면역 주사=70,73,2
나. ELISA test=71,74,2
다. 동물세포 배양=72,75,1
1) Cell의 보관=72,75,1
2) cell의 해빙=72,75,2
3) Cell counting(Hemacytometer)=73,76,1
4) 세포의 유지배양=73,76,1
라. B-Lymphocyte와 myeloma cell의 융합=73,76,3
마. anti-MBP/p60 IgG를 생산하는 hybridoma cell의 선별=75,78,4
1) 선별된 hybridoma cell의 상등액을 이용한 ELISA=78,81,2
2) Hybridome의 상등액을 이용한 재조합 p60단백질의 Western detection=79,82,3
3) 선별된 hybridoma의 상등액을 이용한 재조합 p60 단백질의 ELISA=81,84,3
바. 제한 희석법을 통한 anti-MBP-p60/mono 단일클론항체의 선별=83,86,1
2. 단일클론항체의 Listeria monocytogenes 특이적 역가 test=84,87,1
가. 선별된 hybridoma를 이용한 L. monocytogenes의 세포의 단백질 p60의 ELlSA=84,87,3
나. 선별된 hybridoma를 이용한 Listeria spp. 에 대한 p60단백질의 ELISA=86,89,4
다. 선별된 hybridoma를 이용한 Listeria spp. 에 대한 p60단백질의 Western blot=89,92,3
라. Ascite fluid 제작=91,94,2
제3절 Listeria Flagella 항체제조=92,95,1
1. 다클론항체=92,95,1
가. Rabbit polyclonal antibody=92,95,1
나. Chick yolk antibody(IgY)의 생산 및 분리=92,95,2
1) IgY 역가 변화=93,96,1
2) IgY의 SDS-PAGE=93,96,2
2. 단클론항체의 생산=94,97,1
가. Listeria monocytogenes 4b의 flagella에 대한 Mabs의 생산=94,97,2
나. 항체가 측정을 위한 ELlSA=95,98,1
다. 단클론항체의 복수생산=95,98,2
라. 항체의 정제=96,99,1
3. Sandwich ELISA의 개발=96,99,1
가. 교차반응 조사=96,99,2
나. HRP labelled 항체(detector항체)의 제작=97,100,1
1) Detector항체 역가=97,100,1
다. Capture항체와 detector항체의 조합조건=98,101,1
1) Capture항체와 detector항체의 조합조건=98,101,2
라. 특이도 조사=99,102,2
마. 민감도 조사=100,103,2
4. Lateral flow rapid kit의 개발=102,105,1
가. Colloidal gold=102,105,1
나. Colloidal gold-항체 중합체 제작=102,105,1
다. Lateral flow rapid kit의 구성=102,105,2
1) Lateral flow rapid kit의 구성=103,106,1
라. Capture항체와 detector항체의 조합조건=103,106,2
마. 교차반응=104,107,2
바. 특이도=105,108,2
사. 민감도=106,109,2
제5장 개발된 검색키트와 표준검사법 및 상용키트와의 비교실험=108,111,1
제1절 서설=108,111,1
제2절 표준검사법 및 균주의 확보=108,111,1
1. 시료 채취=108,111,1
2. 검사방법=108,111,1
가. 균분리 및 보관=108,111,8
제3절 개발된 키트들과 수입키트간의 비교검사=115,118,1
1. 개발된 키트와 수입키트간의 비교검사=115,118,2
가. 수입키트들의 검출한계 조사=116,119,1
나. 수입키트들의 L. monocytogenes 종동정 성능=117,120,1
2. 세계 각국에서 유래된 Listeria 균주들에 대한 개발 키트의 적용실험=117,120,2
제6장 참고자료 및 문헌=119,122,7
영문목차
[title page etc.]=0,1,7
Summary=5,8,3
Contents[파오손면;p.11]=8,11,10
Chapter1 Introduction=18,21,1
Section1 Purpose and the details of research=18,21,1
1. Purpose of project=18,21,2
2. The details of project=19,22,1
A. The development of Listeria rapid detection by using PCR=19,22,1
B. The development of Listeria species confirmation detection by using PCR=19,22,1
C. The production of Listeria specific antigen protein by using recombinant DNA technique=19,22,1
D. The production of polyclonal antibody for the Listeria ELISA test=19,22,2
E. The production of monoclonal antibody for the Listeria ELISA test=20,23,1
F. The development of Listeria ELISA system for lab-scale=20,23,1
G. The development of immunochromatographic method for the field test=20,23,1
H. Standard method for the isolation of Listeria spp. and the comparative test between developed kits and imported kits=20,23,1
Section2 Background of development=21,24,1
1. Technical views in listerial detection=21,24,6
2. Economic and industrial views in listerial detection=26,29,2
3. Social and cultural views in listerial detection=27,30,2
Section3 Listeria detection kits in land and imported=29,32,1
1. Technical levels of listerial detection in land=29,32,3
2. Aspects and now what?=31,34,2
Chapter2 Listeria spp. PCR detection kit=33,36,1
Section1 Introduction=33,36,1
Section2 The development of Listeria PCR detection kit=33,36,1
1. Listeria strains=33,36,2
2. Oligonucleotide primers=34,37,2
3. The efficiency of detection of Listeria Multiplex PCR with type strains=36,39,2
4. SIW III Multiplex PCR for the detection of L.ivanovii, L.seeligeri, L.welshimeri=37,40,2
5. The best condition of L.ivanovii detection using Gradient PCR=38,41,2
6. The comparative Lest of chromosomal DNA isolation Methods for the Listeria Multiplex PCR=40,43,3
7. The efficiency of detection using Multiplex PCR in food-samples=42,45,2
8. PCR dctection in milk-samples=43,46,1
A. The efficiency of detection using PCR in Milk-samples=43,46,2
B. The recovery-rate of L.monocytogenes from milk usirlg centrifugation=44,47,2
C. The PCR detection limit of L.monocytogenes in milk=45,48,2
D. Optimal conditions for the best PCR detection=46,49,1
Chapter3 Antigen production of Listeria spp.=47,50,1
Section1 Introduction=47,50,2
Section2 The recombinant p60 antigen of Listeria=48,51,1
1. Molecular cloning of p60 protein=48,51,1
A. Culture of Listeria spp. and purification of genomic DNA=48,51,2
B. Amplifcation of iap gene using PCR and T-vector cloning=49,52,2
C. Subcloning into pMAL-c2 expression vector=51,54,4
2. Expression of recombinant Listeria spp. p60 protein=54,57,1
A. Comparative test for expression-condition of recombinant p60 protein=54,57,1
1) Expression of MBP-p60/mono=54,57,1
a) IPTG concentration in expression of MBP-p60/mono=54,57,2
b) Induction time in expression of MBP-p60/mono=55,58,2
2) Expression of MBP p60/grayi=56,59,3
3) Expression of other Listeria p60 recombinant proteins=58,61,4
3. Mass production of recombinant p60 protein and its purification=61,64,1
A. Purification of MBP-p60/mono and MBP-p60/iva proteins=61,64,2
B. Purification of MBP-p60/grayi proteins=62,65,2
4. Prodtein concentration=64,67,1
5. Concentraion of extracellular protein=64,67,1
Section3 Flagella antigen production of Listeria spp=64,67,1
1. Culture=64,67,2
2. Isolation of flagella=65,68,1
3. Identification of antigen=65,68,1
A. SDS-PAGE=65,68,1
1) fIagella protein in SDS-PAGE=65,68,2
B. Expression of flagella=66,69,1
2) TEM(Transmission EIectron Microscope)=68,71,1
A) Purification of flagella using ultracentrifuge=68,71,1
Chapter4 AntiListeria antibody production and the production of ELISA kit and rapid kit=69,72,1
Section1 Introduction=69,72,2
Section2 The production of anti-p60 monoclonal antibody=70,73,1
1. Monoclonal antibody of Listeria monocytogenes anti-p60=70,73,1
A. Immunization of Listeria monocytogenes recombinant p60 antigen=70,73,2
B. ELISA test=71,74,2
C. Animal cell culture=72,75,1
1) Strage of Cell=72,75,1
2) Recovery of Cell=72,75,2
3) Cell counting (Hemacytometer)=73,76,1
4) Subculture of cell line=73,76,29
4.=102,105,1
A. Colloidal gold=102,105,1
B. Production of Colloidal gold-antibody polmer=102,105,1
C. Construction of Lateral flow rapid kit=102,105,2
1) Construction of Lateral now rapid kit=103,106,1
D. Combination-conditions between Capture AB and detector AB=103,106,2
E. Cross-reaction=104,107,2
F. Soecificity=105,108,2
G. Sensitivity=106,109,2
Chapter5 Comparative test between developed kits and Commerical kits=108,111,1
Section1 Introduction=108,111,1
Section2 Standard test and collection of strains=108,111,1
1. Sample collection=108,111,1
2. test methods=108,111,1
A. Isolation and storage of strains=108,111,8
Section3 Comparative test between developed kits and commerical kits=115,118,1
1. Comparative test between developed kits and commerical kits=115,118,2
A. Detection limit of commerical kits=116,119,1
B. Species-identification of L. monocytogenes using commerical kits=117,120,1
2. Application test of developed kits with strains isolated from over the world=117,120,2
Chapter6 Reference=119,122,7
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