표제지

제출문

보고서 초록

요약문

Summary

Contents

목차

제1장 연구개발과제의 개요 15

1. 연구개발의 목적 15

2. 연구개발의 필요성 15

가. 기술적 측면 15

나. 경제적 측면 17

다. 사회적 측면 17

3. 연구개발의 범위 18

제2장 국내외 기술개발 현황 19

1. 국내외 기술개발 현황 19

1) 방사선 조사에 따른 세포사멸 19

2) DNA 손상에 따른 세포 반응 19

3) 세포사멸 기전 20

4) G 단백질에 의한 세포사멸 조절 20

5) 방사선 치료 sensitizer 21

2. 연구결과가 국내외 기술개발 현황에서 차지하는 위치 22

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 23

1. 연구개발수행 내용 23

2. 연구결과 24

가. G 단백질 알파소단위의 항시활성형 돌연변이인, GasQL 과 Gai2QL을 SH-SY5Y neuroblastoma 세포주에 안정적으로 과발현시킨 stable cell line을 수립하였다. 24

나. GasQL과 Gai2QL을 다양한 암세포주에 발현시키고 이들이 siRNA를 이용하여 G 단백질을 knock down하기 위하여 adenoviral expression system과 lentiviral expreesion system을 도입하였다. 25

다. Gas 단백질이 X-선 조사에 따른 신경모세포종 세포주의 사멸에 미치는 영향과 분자 기전을 구명하였다. 26

라. Gai2 단백질이 X-선 조사에 따른 사람 신경모세포종 세포주의 사멸에 미치는 영향 분석 31

마. G 단백질 수용체의 agonist와 antagonist가 방사선에 의한 세포사멸에 미치는 영향 32

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 35

1. 연구개발 목표 달성도 35

가. 최종 목표 35

나. 연구목표 달성도 35

2. 관련분야에의 기여도 36

가. 기술적 측면 36

나. 경제, 산업적 측면 36

제5장 연구개발결과의 활용계획 37

가. 경제적 측면 37

나. 사회적 측면 37

다. 기술적 측면 37

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 38

제7장 참고문헌 39

I. 제목

방사선 조사에 의한 세포사멸을 조절하는 Gas 단백질의 작용기전 구명과 수용체 선별

II. 연구개발의 목적 및 필요성

이 연구는 방사선치료의 효율을 향상시키는 방법을 개발 하는 연구에 기여하기 위하여, 신호전달 Gas 단백질이 방사선 조사에 의한 세포사멸을 조절하는 기전을 구명하고, 이 G 단백질을 활성화하여 방사선조사에 의한 세포사멸을 조절할 수 있는 수용체를 선별하는 것이 이 연구의 목적이다.

가. 기술적 측면

1) 방사선치료는 암을 치료하는 중요한 방법이다.

방사선 치료는 전리방사선을 사용하여 양성과 악성 종양을 치료하는 방법으로서, 이는 외과적 수술, 항암제 투여, 그리고 최근에 도입된 생물학제 제재를 이용한 치료법과 함께 암을 치료하는 중요한 방법이다. 방사선 치료는 소아나 성인에 발생한 각종 암의 치료에 사용되며, 완치가 가능하지 않은 경우에도 증상완화를 목적으로 빈번하게 시행되고 있다.

2) 방사선 치료는 암세포뿐만 아니라 정상세포를 파괴하여 부작용을 유발하며, 어떤 암세포는 방사선에 의해 죽지 않는 저항성을 나타낸다.

방사선치료에 사용된 전리 방사선은 암세포의 여러 고분자 특히 DNA에 손상을 유발하여 암세포를 파괴한다. 그러나 이러한 세포 사멸작용은 암세포에 대한 특이성이 낮기 때문에 정상세포도 파괴하여 여러 가지 급성과 만성 부작용을 유발하게 된다. 또한 일부 암세포는 전리 방사선에 의해서 파괴 되지 않는 저항성을 획득함으로써 치료가 성공적으로 이루어지지 않는 경우가 많이 발생한다.

3) 방사선조사에 대한 암세포의 방사선 감수성을 증가시키거나 정상세포의 저항성을 증가시켜서 방사선치료의 효율을 향상시키려는 연구가 진행되고 있다.

방사선조사에 대한 암세포의 감수성은 암세포의 종류, 암세포의 세포주기분포, 암세포에 대한 산소공급 등에 의해서 영향을 받는다. 암세포의 방사선에 감수성은 환자의 병기와 종양의 증식속도와 함께 방사선 치료 효율에 영향을 미치는 주요 인자이다. 따라서 암세포의 방사선 감수성을 증가시킴으로 써 방사선치료 효과를 향상시키려는 노력이 경주되어 왔다. 암세포의 방사선 감수성을 향상시키기 위하여 여러 가지 약제들이 연구되어 왔지만, 이 약제들의 독성이 심하여 그 전망이 불투명하였다. 한편 방사선 조사에 의한 정상세포의 사멸을 방지하는 radioprotector에 대한 연구도 진행되고 있다. free radical을 제거하여 정상세포를 보호하는 amifostine, 골수에서 혈액생산을 증가시킴으로써 tolerance를 증가시키는 interleukin-1 and granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) 등이 주된 radioprotector로 연구되고 있다.

4) 암세포의 방사선 감수성을 증가시키거나 정상 세포의 방사선 저항성을 증가시킬 수 있는 약물 을 개발하기 위한 target molecule을 찾아내기 위해서는 방사선 조사에 의한 세포사멸 기전과 이의 조절 기전을 좀 더 체계적으로 구명하는 연구가 필요하다.

암세포의 방사선에 대한 감수성을 증가시키는 radiosensitizer나 정상 세포의 방사선 저항성을 증가시킬 수 있는 radioprotector를 개발하기 위해서는 방사선 조사에 의한 세포사멸 기전과 이의 조절 기전을 좀 더 체계적으로 구명하는 연구가 필요하다. 지금까지 방사선 조사에 따른 암세포의 사멸에 관하여 많은 연구가 진행되어서 여러 종류의 분자들이 이에 관여한다고 밝혀졌다. 그러나 지금까지의 연구결과가 새로운 radisensitizer나 radioprotector의 개발로 발전한 예는 많지 않다. 따라서 새로운 radiosensitizer나 radioprotector를 개발하기 위해서는 새로운 molecular target을 찾아내기 위한 연구가 필수다.

5) G 단백질 신호전달계는 다양한 신호를 받아서 세포의 사멸, 증식 분화를 조절하므로, G 단백질 신호전달계의 활성을 조절함으로써 방사선 조사에 의한 암세포의 사멸을 조절할 수 있는 새로운 방법을 개발할 수 있을 것으로 기대한다.

신호전달 G 단백질은 1000 여 가지가 넘는 신호물질이 세포막에 위치한 특이 수용체에 결합할 때에 활성화 되어 adenylate cyclase나 phospholipase C beta 등의 효과기 활성을 조절함으로써 다양한 세포 반응을 유발한다. 이러한 G 단백질 신호전달계는 세포의 대사를 조절할 뿐만 아니라 세포의 성장, 증식, 분화, 사멸을 조절한다고 알려져 있어서, G 단백질 신호전달계의 활성을 조절하면 방사선 조사에 의한 세포의 사멸을 조절할 수 있음을 시사한다. 특히 G 단백질 수용체는 세포막에 위치하여 신호물질이나 약물에 의해서 특이적으로 활성화되기 때문에 세포에 대한 반응 특이성이 높으며, 약물을 암세포에 특이적으로 전달하기가 비교적 용이하여 radiosensitizer 개발을 위한 좋은 표적분자 의 특성을 갖추고 있다. 따라서 암세포의 G 단백질 신호전달계의 활성을 특이적으로 조절하여 방사 선 조사에 의한 암세포의 사멸을 특이적으로 조절할 수 있을 것으로 기대한다.

이러한 연구는 아직까지 학계에 보고 되지 않은 독창적인 접근방법으로서, 이 분야의 연구에 새로운 영역을 개척할 수 있을 것으로 기대한다.

나. 경제적 측면

우리나라는 경제 수준의 향상과 의료 서비스가 개선됨에 따라서 암, 순환기 질환과 퇴행성 뇌질환 등 만성질환의 발생 빈도가 급격히 증가하고 있다. 특히 암은 환자의 수명을 급격하게 감소시켜서 경제 인구를 감소시킬 뿐만 아니라, 환자의 치료비 부담이 환자의 가족이나 사회에 커다란 부담으로 작용하고 있다. 이러한 종양을 치료하는 대표적인 방법의 하나가 방사선 치료이다. 그러나 방사선 조사에 저 항성을 나타내는 종양은 방사선 요법으로 성공적인 치료가 이루어지지 않는다. 따라서 이러한 방사선 에 대한 암세포의 저항성을 저하시키는 radiosensitizer나 암의 방사선 치료에서 발생하는 정상 조직의 손상을 방지할 수 있는 radioprotector를 개발하는 것은 방사선치료법에 의한 암의 치료성공률을 크게 향상시켜서 환자의 생명을 연장하는 데에 기여할 것이다. 이러한 radiosensitizer나 radioprotector는 모든 선진국에서 암의 방사선 치료에 필요로 하기 때문에, 이러한 약물을 개발하면 그 시장이 거대하므로 큰 수익을 올릴 수 있으며, 우리나라 의약학 산업의 발전에 크게 기여할 수 있을 것이다.

따라서 암의 방사선 치료 효율을 증가시키는 방법을 개발하면, 암환자의 치료에 소요되는 비용을 절감할 뿐만 아니라 국내 의약 산업의 발전에도 기여할 수 있으므로, 방사선 조사에 의한 세포의 사멸을 조절할 수 있는 약물이나 방법을 국내에서 개발할 필요성이 크며, 이를 뒷받침하기 위해서는 방사선조사에 따른 세포의 사멸 기전과 이를 조절하는 기전을 구명하는 연구가 심도 있게 시행되어야 한다.

다. 사회적 측면

의학을 비롯한 생명과학의 발전과 경제 성장에 힘입어 인간의 평균수명이 계속 증가하여 왔다. 우리나라도 감염 등에 의한 사망이 감소하면서, 암에 의한 사망이 전체 사망원인에서 높은 비중을 차지하고 있다. 또한 암은 환자의 수명을 급격히 단축시킬 뿐만 아니라 그 가족 구성원의 삶의 질을 크게 저하 시키고 있다. 모든 사람들은 암의 발생 가능성에 대하여 매우 두려워하고 있으며, 환자의 가족 또한 이러한 질환의 발생에 따른 경제적, 사회적 지출에 상당한 부담을 느끼고 있으며, 가족 구성원 사이에는 환자의 부양에 따르는 경제, 사회, 문화적 문제로 갈등이 일어나는 경우가 많다. 따라서 이러한 암을 효율적으로 치료할 수 있는 방법을 개발하는 연구가 사람의 삶의 질을 향상시키고, 사회적인 갈등을 해소하는 데에 크게 기여할 것이다. 암의 방사선 치료법을 개선하는 연구가 이에 기여할 것이다.

III. 연구개발의 내용 및 범위

이 과제의 최종 목표인 신호전달 Gas 단백질이 방사선 조사에 의한 세포사멸을 조절하는 기전을 구명하고, 이 G 단백질을 활성화하는 수용체를 선별하기 위하여,

1차년도에는

1) Gas 단백질의 항시활성형 돌연변이와 siRNA를 발현시키는 viral expression system을 확립한다.

2) Gas 단백질이 X-선 조사에 따른 사람 신경모세포종 세포주의 사멸을 조절하는 분자 기전을 구명한다.

2차년도에는

3) 사람 신경모세포종 세포주에 발현하는 Gs 단백질 결합수용체를 bioinformatics와 RT-PCR 방법을 이용하여 분석함으로서 X-선 조사에 따른 세포사멸에 미치는 영향을 분석한다.

4) 발현하는 Gs 단백질 결합수용체의 agonist나 antagonist가 X-선 조사에 따른 사람 신경모세포종 세포주의 사멸에 미치는 영향을 분석한다.

IV. 연구개발결과

1. G 단백질 알파소단위의 항시활성형 돌연변이인, GasQL 과 Gai2QL을 SH-SY5Y neuroblastoma 세포주에 안정적으로 과발현시킨 stable cell line을 수립하였다.

2. GasQL과Gai2QL을 다양한 암세포주에 발현시키고 이들의 siRNA를 이용하여 G 단백질을 knock down하기 위하여 adenoviral expression system과 lentiviral expression system을 도입하여 만들었다.

3. Gas 단백질이 X-선 조사에 따른 사람 신경모세포종 세포주의 사멸에 미치는 영향과 분자 기전을 구명하였다.

1) Gas 단백질이 안정적으로 과발현된 stable cell에 X-ray irradiation을 준 결과, vector cell에서 PARP cleavage와 Caspase-3과 Caspase-9 cleavage가 증가된 결과에 반해, Gas cell에서는 이들의 cleavage가 현저히 감소되어 결국 X-ray에 의한 apoptosis로부터 protective effect가 있음을 확인할 수 있었다. 또한 vector cell에서 방사선을 조사하면 Cytochrome-c가 mitochondria에서 cytosol로 release 되고, Caspase-9의 cleavage form(35kDa)이 증가되었다. 이는 cytosol로 release된 Cytochrome-c가 Apaf-1에 결합하여 Caspase-9과 apoptosome complex를 이루어 Caspase-9을 activation시켰음을 나타낸다. 이러한 결과는 GasQL가 SH-SY5Y 세포주의 radiation에 대한 저항성을 증가시킴을 나타낸다. 또한 이러한 결과는 Gas 단백질의 siRNA를 발현하면 H2O2에 의한 세포사멸이 억제된다는 결과와 부합한다.

2) 신호전달 Gas 단백질이 방사선에 의한 세포사멸을 억제하는 기전을 구명하기 위하여 세포사멸에 관여하는 분자에 미치는 영향을 분석하였다.

우선 Death receptor family protein의 mRNA 발현을 RT-PCR로 분석한 결과, Gas 단백질은 SH-SY5Y cell에서는 Death receptor를 경유하는 방사선에 의한 세포사멸에는 영향을 주지 않음을 확인하였다. Gas 단백질이 세포사별에 관여하는 다른 분자에 미치는 영향을 Western blot법으로 분석하였다. 분석결과를 보면, 방사선 조사에 따는 DNA damage에 의해 p53의 expression이 증가되었고, p53의 transcriptional target인 p21(a cyclin-dependent kinase inhibitor)도 다량으로 induction됨 알 수 있었으며, 반면 Gas cell에서는 방사선에 의한 이들의 induction이 현저히 inhibition되었다.

또한, Gas가 방사선에 의한 Bak의 발현과 Bcl-xL의 감소를 억제하여 방사선에 의한 세포사멸을 억제하였다.

3) Gas가 X-조사에 따른 Bak의 발현을 억제하는 것이 Gas가 X-선 조사에 의한 세포사멸을 억제하는 기전임을 검정하기 위해서 세포에 Bak을 과발현시키고 X-선 조사에 따른 세포사멸에 미치는 영향을 분석하였다.

분석결과 Bak을 과발현하면 Gas가 과발현되지 않은 세포에서 X-선 조사에 따른 세포사멸을 증가시켰으며, 또한 Gas가 과발현한 세포주에서도 X-선 조사에 의한 세포사멸을 증가시켰다. 이 연구결과는 Gas가 X-선에 의한 Bak의 발현을 억제함으로써 X-선에 의한 세포사멸을 억제함을 의미한다.

4) Gas에 의해서 억제되는 방사선조사에 의한 Bak의 발현 유도는 활성산호를 제거하는 N-acetyl cysteine에 의해서 세포의 사멸과 함께 억제가 되어서, Bak의 발현유도는 활성산소에 의해서 매개되며 이는 세포사멸을 일으키는 데에 관여할 것을 시사한다.

5) Bcl-xL protein을 knockdown시키면 radiation에 의한 세포사멸을 또한 증가시켰으며, Gas에 의한 사멸억제 효과도 제거 되어서, Gas가 Bak과는 반대로 Bcl-xL의 발현을 증가시킴으로써 세포사멸을 억제함을 알 수 있다. 이는 Bcl-xL mRNA 수준에서도 마찬가지로 radiation에 의한 발현감소가 억제되었음을 확인하였다.

4. Gai2 단백질이 X-선 조사에 따른 사람 신경모세포종 세포주의 사멸에 미치는 영향 분석

항시활성형 Gai2돌연변이 단백질이 과발현된 stable cell line에 방사선을 조사하면 vector가 발현된 세포에 비해 Caspase-3 cleavage가 현저히 증가되어 apoptosis가 증가되었다. 또한 Gai2 단백질은 Gas 단백질이 나타내던 X-선에 의한 세포사멸 억제효과를 감소시켰다. 이러한 연구결과는 Gai2 단백질이 Gas 단백질과는 반대로 X-선에 의한 세포사멸을 촉진함을 나타낸다.

5. G 단백질 수용체의 agonist와 antagonist가 방사선에 의한 세포사멸에 미치는 영향

1) Gas를 활성화시켜 adenylate cyclase를 촉진시키는데 관여하는 PGE2로 SH-SY5Y 세포를 처리하면 radiation에 의한 Caspase-3와 PARP의 cleavage가 감소되어, 세포사멸이 억제됨을 나타냈다. PGE2가 결합하는 수용체인 EP2와 EP4 antagonist를 처리했을 때 PGE2에 의한 세포사멸 억제가 감소되었고, 반면에 Gai2를 활성화시켜 adenylate cyclase를 억제시키는데 관여하는 EP1 receptor의 antagonist를 처리 하면 세포사멸이 현저히 감소하는 결과를 확인하였다.

이러한 결과는 Gas 단백질을 과발현하였을 때에 나타나는 결과와 일치하여, PGE2가 Gas를 활성화하는 EP2, EP4 수용체를 활성화함으로써 방사선에 의한 세포사멸을 억제함을 나타낸다.

이 결과는 G 단백질의 수용체 활성을 조절하면 방사선에 의한 세포사멸을 조절할 수 있음을 시사한다.

2) Adenosine A1 receptor agonist인 R-PIA와 CCPA로 SH-SYSY 세포를 처리했을 때 방사선에 의한 Caspase-3와 PARP의 cleavage가 증가하여, 이들이 방사선에 의한 세포사멸을 촉진함을 나타냈다. 이 결과는 PGE2 수용체 연구결과와 더불어 G 단백질 결합수용체의 agonists와 antagonists가 Gas/Gai-cAMP signaling pathway에 관여함으로써 radiation에 의한 세포사멸을 조절하며, 나아가서는 이러한 수용체의 agonist나 antagonist에 의하여 방사선에 의한 세포사멸을 조절할 수 있음을 시사한다.

V. 연구개발결과의 활용계획

가. 경제적 측면

이 연구결과에 의하면, 신호전달 Gas 단백질과 Gai2 단백질이 방사선 조사에 의한 세포 사멸을 조절하는 기전으로 mitochondrial pathway를 활성화시키는데 관여하는 Bak protein과 Bcl-xL protein과 같은 Bcl-2 family protein을 조절함으로써 세포의 사멸을 효과적으로 조절할 수 있고, 특이적으로 Gas와 Gai2를 활성화시키는 다양한 agonists와 antagonists를 이용하여 방사선 조사에 의한 세포사멸을 조절 하는 특이적인 물질을 개발하는 연구에 크게 기여할 것이다. 특히 특이분자표적 (specific molecular targeting)을 이용한 보다 효과적이고 독성이 적은 radiosensitizer를 개발함으로써 암의 방사선 치료의 효율을 향상시켜 암치료에 지불하는 경제적인 비용을 크게 감소 시킬 수 있을 뿐만 아니라 미래 산업으로 각광 받고 있는 의약학 산업의 발전에도 기여할 것으로 기대한다.

나. 사회적 측면

생명과학의 발전과 경제 성장에 힘입어 인간의 평균수명이 증가된 반면, 환경오염과 불규칙한 식습관 및 생활습관의 불균형 같은 다양한 원인으로 암에 의한 사망이 점차 증가되어 인간의 수명을 급격히 단축시킬 뿐만 아니라 가족 구성원의 삶의 질은 크게 저하시키고 있다. 이 연구결과를 통하여 신호 전달 Gas 단백질과 Gai2 단백질을 활성화함으로써 방사선 조사에 의한 세포사멸을 조절하는 수용체를 선별해내면, 방사선 조사에 의한 암세포의 사멸을 촉진하거나 정상세포의 사멸을 억제함으로써 방사선 치료의 효율을 향상시키는 약물 또는 방법을 개발하는 데에 활용할 수 있을 것이다. 따라서 암을 효과 적으로 치료할 수 있는 방법을 개발하는 연구를 통해 인간의 삶의 질을 향상시키고, 환자 본인뿐만 아니라 환자의 가족 또한 경제적, 사회적 지출에 대한 상당한 부담을 줄이는데 이바지할 것이다.

다. 기술적 측면

이 연구는 아직까지 학계에 보고 되지 않은 연구로서, G 단백질 결합 수용체의 결합특이성을 이용하여 암세포를 쉽게 제거 시킬 수 있는 radiosensitizer나 방사선 치료에서 발생하는 정상 조직의 손상을 방지 할 수 있는 radioprotector를 개발하는 새로운 치료방법을 모색함으로써 암의 치료성공률을 크게 향상 시키는데 이바지 할 것이다 또한, 신호전달 Gas 단백질과 Gai2 단백질 신호전달계가 방사선 조사에 의한 세포사멸을 조절하는 분자기전을 밝힘으로서 표적 molecules를 선별할 수 있고, 신호전달 G 단백질이 방사선 조사에 의한 세포사멸을 조절하는 분자기전을 구명함으로써 방사선 조사에 의한 세포사멸 조절의 이상으로 암이 발생하거나 방사선 치료에 저항성을 나타내는 기전에 대한 이해를 증진시킬 것으로 기대한다.