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Summary

CONTENTS

목차

제1장 연구개발과제의 개요 25

1. 연구 개발의 목적 25

2. 연구 개발의 필요성 25

가. 경제, 사회적 측면 25

나. 기술적 측면 26

다. 사회·문화적 측면 27

3. 연구 개발의 범위 28

가. Lentivirus system을 이용한 유전자 전달 시스템의 확립 28

나. 세포내에서의 shRNA hAIMP2-DX2의 항암효과 검증 28

다. 폐암 모델 마우스에서의 shRNA mAIMP2-DX2의 항암효과 검증 28

제2장 국내외 기술개발 현황 29

1. 국내외 기술개발현황 29

가. 외국의 경우 29

나. 국내의 경우 30

다. 조사연구개발사례에 대한 평가 31

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 33

제1절 Lenti-virus system을 이용한 유전자 전달 시스템의 확립 33

1. 서론 33

2. 재료 및 방법 33

3. 결과 및 고찰 37

(1) Lenti-virus GFP 발현 확인 37

(2) hAIMP2와 hAIMP2-DX2 유전자를 포함한 lenti-virus 합성 38

(3) 합성된 lenti-virus의 검증 44

(4) hAIMP2-DX2에 대한 shRNA를 포함한 lenti-virus 합성 47

(5) hAIMP2-DX2 target shRNA를 발현하는 lenti-virus의 검증 실험 49

4. 요약 50

제2절 세포내에서의 hAIMP2-DX2의 항암효과 검증 51

1. 서론 51

2. 실험재료 및 방법 52

3. 결과 및 고찰 55

(1) 다양한 폐암 세포주에서 hAIMP2-DX2의 발현 양 확인 55

(2) 다양한 폐암 세포주로부터 EGFR의 발현 양 확인 56

(3) hAIMP2-DX2 target shRNA 처리에 의한 단백질 발현 감소 확인 57

(4) shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 Glucose Transporters (Gluts) 발현 양 58

(5) Glucose 처리에 의한 O-glycosylation 증가 59

(6) shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 Glycosyltransferase (GnT) 발현 양 61

(7) Glucose 처리에 의한 EGFR 증가 63

(8) shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 MAPK signaling pathway 관련 단백질의 감소 65

(9) shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 단백질 번역 (translation)의 감소 67

(10) shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 세포 증식의 감소 68

(11) hAIMP2-DX2와 연관된 Signaling Pathway 모식도 69

4. 요약 70

제3절 폐암 모델 마우스에서의 mAIMP2-DX2의 항암효과 검증 71

1. 서론 71

2. 재료 및 방법 72

3. 결과 및 고찰 75

(1) mAIMP2-DX2에 대한 shRNA를 포함한 lenti-virus target sequence 75

(2) mAIMP2-DX2에 대한 shRNA를 포함한 lenti-virus 효과 검증 75

(3) shRNA mAIMP2-DX2 shRNA가 lung cell hyperplasia에 형성에 미치는 영향 확인 77

(4) shRNA mAIMP2-DX2 shRNA가 Akt의 활성화에 미치는 영향 79

(5) shRNA mAIMP2-DX2 가 Akt-related protein 의 활성화에 미치는 영향 81

(6) shRNA mAIMP2-DX2 가 protein translation 에 미치는 영향 83

(7) shRNA mAIMP2-DX2 가 VEGF의 활성에 미치는 영향 84

4. 요약 85

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 86

1. 목표달성도 86

2. 관련분야 기여도 86

제5장 연구개발결과의 활용계획 90

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 91

제7장 참고문헌 94

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 33

표 1. Human의 AIMP2 합성을 위한 primer 38

표 2. Human의 AIMP2-DX2 확인을 위한 primer 45

표 3. Human의 hAIMP2-DX2에 대한 shRNA target 서열 47

표 1. Mouse의 mAIMP2-DX2에 대한 shRNA target 서열 75

Table 1. shRNA mAIMP2-DX2 처리에 의한 lung cancer hyperplasia에 대한 영향.... 78

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 91

표 1. Virus 질환, 암, 유전자질환의 원인유전자에 해당하는 RNAI 적용 예 93

제1절 Lenti-virus system을 이용한 유전자 전달 시스템 확립 33

그림 1. Lenti-virus system을 이용한 형광발현유전자(GFP)의 발현... 37

그림 2. NCI-H460으로부터의 total RNA(A) hAIMP2 primer를(prmer를) 이용한 RT-PCR(B) 38

그림 3. Cloning vector pENTR 1A와 hAIMP2와 hAIMP2-DX2의 cloning... 39

그림 4. 삽입된 유전자 확인을 위한 PCR... 39

그림 5. 유전자의 발현을 위한 vector(A)와 재조합 형질 전환 된 plasmids(B)... 40

그림 6. hAIMP2(A)와 hAIMP2-DX2(B) 유전자의 상동성 분석 41

그림 7. RT-PCR에 의한 hAIMP2와 hAIMP2-DX2 유전자의 과 발현 확인 44

그림 8. hAIMP2-DX2의 발현량 확인... 45

그림 9. Western blot에 의한 hAIMP2 단백질의 과발현 확인 46

그림 10. Cloning vector pENTR/U6과 hAIMP2-DX2 siRNA cloning한 plasmids... 47

그림 11. siRNA 발현을 위한 vector와 재조합 형질 전환 된 plasmids... 48

그림 12. RT-PCR에 의한 hAIMP2-DX2 유전자의 감소 확인... 49

제2절 세포내에서의 hAIMP2-DX2의 항암효과 검증 51

그림 1. 다양한 폐암 세포주로부터 hAIMP2-DX2의 발현 양 확인... 55

그림 2. 다양한 폐암 세포주로부터 EGFR의 발현 양 확인 56

그림 3. shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 단백질 발현 감소... 57

그림 4. shRNA hAIMP2-DX2 처리 후 Gluts의 발현 양... 58

그림 5. Glucose 처리에 의한 O-glycosyiation 증가.... 60

그림 6. shRNA hAIMP2-DX2 처리 후 GnT의 발현 양.... 62

그림 7. Glucose 처리에 의한 EGFR 증가.... 64

그림 8. shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 MAPK signaling pathway 관련 단백질의 변화.... 65

그림 9. shRNA hAIMP2-DX2 처리에 의한 luciferase activity 감소 67

그림 10. shRNA hAIMP2 처리 후 Ki-67의 발현 양... 68

그림 11. hAIMP2-DX2와 연관된 Signaling Pathway 모식도 69

제3절 폐암 모델 마우스에서의 mAIMP2-DX2의 항암효과 검증 71

그림 1. shRNA mAIMP2-DX2 처리에 의한 DX2 발현양의 확인.... 76

그림 2. shRNA mAIMP2-DX2 처리에 의한 Akt 발현양의 확인.... 79

그림 3. shRNA mAIMf2-DX2 처리에 의한 Akt 관련 pathway 확인.... 81

그림 4/3. shRNA mAIMP2-DX2 처리에 의한 protein translation관련 pathway 확인.... 83

그림 5/3. shRNA mAIMP2-DX2처리에 의한 VEGF의 발현양 확인.... 84

I. 제목

p38을 이용한 유전자 치료제 개발 및 질환동물 모델 개발

II. 연구개발의 목적 및 필요성

1. 연구개발의 목적

암은 유전자의 변이에 의해서 유전자의 조절 장해로 인해 발생하는 질환이다. 그러나 현재 사용되어지고 있는 암 치료를 위한 유전자 치료 기술은 암세포에서 변이되어 특이적으로 발현되는 유전자만을 치료할 수 없다는 한계를 보여주고 있다. 따라서 이런 단점을 극복하면서 효과적으로 유전자를 전달하여 암 치료를 할 수 있는 시스템의 개발과 치료제 개발이 매우 필요한 실정이다.

본 과제는 폐암에서 특이적으로 과발현되어 있는 유전자를 shRNA 시스템을 도입하여 과발현된 유전자의 활성을 억제, 작용기전을 확립함으로써 폐암을 치료하기 위한 치료제개발을 연구 개발의 목적으로 한다.

또한 lentivirus vector 시스템을 도입하여, 유전자 전달의 효율성을 높이고 기존의 분열하는 세포에서 뿐만 아니라 비분열 세포에서도 유전자를 전달하여 특이적으로 발현된 유전자를 조절하여 그 치료의 효율성을 극대화 할 수 있는 새로운 치료 방법의 개발 또한 본 연구 개발의 목표라 할 수 있다.

2. 연구의 필요성

현재 폐암은 전 세계적으로 발병률과 사망률에서 2위를 기록하고 있으며 우리나라에서도 발병률이 계속해서 늘어나고 있는 추세이다. 그러나 폐암은 조기진단이 어렵고 발견 후에 적절한 치료법이 개발되지 않아 많은 사람들이 폐암으로 인해 고통 받고 사망하고 있는 추세이다.

암에 대한 치료법으로 현재까지는 수술요법, 방사선요법 및 항암화학요법 등이 사용되고 있으나 최근 암의 치료에는 한계에 도달한 느낌이다. 이에 새로운 개념의 치료방법이 연구되고 있으며 그 중 하나가 유전자를 이용한 폐암 치료법이다.

유전자 치료법은 암이 유전자의 변이에 의해서 발생한다는 점에서 암의 기본적인 치료법으로 생각된다. 기존의 약물들이 대부분 증상에 대한 치료에 초점을 맞추었다면, 유전자 치료법은 질병의 원인을 유전자 차원에서 해석하여 근본적으로 원인을 제거함으로써 치료하는 방법이다. 그러나 현재 유전자 전달 기술은 유전자 전달의 효율성이 낮고, 암세포에 특이적으로 과발현되는 유전자의 활성만을 조절 할 수 없다는 한계를 보여주고 있다. 따라서 이들 극복하는 것은 효과적인 암 치료에 있어서 매우 필요하다.

기존의 폐암 유전자치료는 주로 비호흡기계를 중심으로 추구되고 있으며 또한 사용 벡터의 문제점들인 효율성, 생체 면역반응 야기 그리고 낮은 재현성 등의 문제들을 가지고 있다. 특히, 벡터 시스템은 유전자치료의 성공을 좌우하는 가장 중요한 요소이다. 현재 임상에서는 바이러스성 벡터 시스템이 주로 사용되어지며, retrovirus는 28%, adenovirus 26%, 그리고 비바이러스 벡터 시스템인 naked DNA는 14% 와 리포좀은 9%의 순이다. 바이러스성 벡터 시스템이 널리 이용되는 이유는 유전자 전달효율이 높고 발현률 및 지속성이 우수하기 때문이다. 이것은 바이러스가 세포 내로 침입하면 자신의 유전물질을 즉시 세포로 옮기는 특성을 이용한 것이다.

Adenovirus는 이중 가닥의 DNA 형태로 분열세포와 비 분열세포에서 높은 발현률을 나타낸다. 그러나 유전자의 발현은 일시적이고, 바이러스 입자가 거의 모든 세포에 감염될 수 있기 때문에 주변 정상세포에 독성을 가질 수 있다.

본 과제에서 사용하는 lentivirus vector는 retrovirus의 일종으로 HIV (human immunodeficiency virus) 골격을 변화시킨 것인데, 다른 retrovirus와 달리 분열하는 세포 뿐 아니라 성장이 멈춘 세포나 분화가 끝난 세포를 감염시킬 수 있다는 장점이 있다. 또한, lentivirus는 안정하게 면역반응을 회피하여 유전 물질을 전달할 수 있고, 유전자의 지속 기간 또한 길다. 따라서 세포의 분열이 계속 진행되는 cancer 종류의 질병뿐만 아니라 다른 질환의 치료를 위한 유전자 전달에도 사용이 가능하다. 이러한 lentivirus system을 이용하여 shRNA를 전달하면, lentivirus의 높은 효율성과 함께 특정 유전자의 발현을 억제 시킬 수 있다. 따라서 유전자의 knock-down 작용을 통하여 유전자 단계에서 질병 치료가 가능하게 된다.

또한, 본 과제에서 적용하는 호흡을 통한 유전자의 잔달 방법의 확립 (inhalation system)은 이후 폐암 치료에 드는 비용을 절감함과 동시에 수술이나 기존 항암 치료에서 동반되는 환자들의 고통을 줄일 수 있으리라 생각되어지며 이러한 유전자 전달 방법의 확립은 이후의 다른 폐 질환에서도 응용이 가능할 것으로 보인다. 따라서 이러한 lentivirus system의 shRNA를 inhalation system에 적용하면 폐암 치료에 큰 효과를 가져 올 것으로 생각된다.

III. 연구개발의 내용 및 범위

제 1장 Lentivirus system을 이용한 유전자 전달 시스템의 확립

기존의 유전자 전달에 사용되었던 비바이러스성 벡터는 유전자 전달의 효율성이 낮고, 전달된 유전자의 지속성과 발현율이 낮다는 단점이 있다. 이런 비바이러스성 벡터의 단점을 보안하여 유전자 전달의 효율성이 높으며, 분열 세포에서 뿐만 아니라 비 분열세포에서도 사용이 가능한 lentivirus 벡터 시스템을 유전자를 이용한 폐암치료 시스템의 개발에 도입하고자 한다.

제 1장에서는 유전자의 변이에 의해 발생되는 암 치료, 그 중 폐암 치료의 목적으로 폐암에서 과발현되어 있는 AIMP2-DX2 유전자를 target 유전자로 선정하여 폐암치료에 응용하고자 한다.

첫번째, lentivirus 시스템을 적용하고자 GFP(Green Fluorescence Protein)을 응용, lentivirus 벡터의 유전자 전달의 가능성을 확인하였다.

두번째, lung cancer에서 과발현되어 있는 AIMP2-DX2 유전자의 활성을 억제하기 위해 shRNA 시스템을 도입하였다. shRNA 시스템을 도입하여, 폐암에서의 활성을 억제시키기 위해 shRNA AIMP2-DX2를 제작하였다.

세번째, lentivirus 벡터에 제작된 shRNA AIMP2-DX2에 삽입하여 새로운 시스템을 제작하였다. 새로운 시스템의 효율성을 확인하기 위해, 세포에 AIMP2-DX2 virus를 감염시켜 AIMP2-DX2의 발현양상을 RT-PCR과 Western blot의 방법을 사용하여 발현양상을 조사하였다.

제 2장 세포내에서의 shRNA AIMP2-DX2의 항암효과 검증

제2장에서는 확립된 시스템을 폐암 세포내에 처리하여 AIMP2-DX2의 활성뿐만 아니라 AIMP2-DX2가 폐암에 작용하는 기전에 대하여 연구하고 그 기전을 바탕으로 폐암 치료제의 개발에 응용하고자 한다.

첫번째, shRNA AIMP2-DX2를 여러 종류의 폐암 세포주에 감염시켜, AIMP2-DX2의 활성 정도를 측정한 후 target cancer cell을 결정한다.

두번째 선정된 lung cancer cell인 H460 세포에 시스템을 적용하고자 shRNA AIMP2-DX2를 시간별, 농도별 처리하여 최적 조건의 실험조건을 선정한다.

세번째, 세포내에서 shRNA AIMP2-DX2의 활성 억제를 검증한 후, shRNA AIMP2-DX2가 폐암세포에서 작용하는 작용기전에 대해서 연구한다 (Glucose transport, EGFR pathway, protein translation 등).

제 3장 폐알 모텔 마우스에서의 shRNA AIMP2-DX2의 항암 효과 검증

제 3장에서는 세포내에서 효율성이 검증된 AIMP2-DX2를 동물 모델에서의 유전자발현의 검증 및 유전자 작용 기전을 연구하여 그 결과를 바탕으로 폐암의 치료기전을 밝히고, 폐암 치료제로써 개발하기 위한 기반 기술을 확보하고자 한다.

첫번째, 폐암 모델 마우스 확보를 위해 benzo(α)pyrene를 이용하여 p38 transgenic mice에 폐암을 유도한다.

두번째, 에어로졸 시스템을 이용하여 shRNA AIMP2-DX2가 있는 lentivirus를 폐암모델 마우스에 전달한다.

세번째, 폐암 모델 마우스에서 shRNA AIMP2-DX2의 활성 억제 효능을 검증한 후, shRNA AIMP2-DX2가 폐암 모델 마우스의 폐에서 작용하는 작용기전에 대해서 연구한다(Akt pathway, protein translation, angiogenesis 등).

IV. 연구개발결과

1. Lentivirus system을 이용한 유전자 전달 시스템의 확립

(가) shRNA AIMP2-DX2의 lentivirus vector 시스템의 삽입

AIMP2-DX2가 과발현되어 있는 NCI-H460 cell에서 total RNA를 분리, lentivirus 벡터 시스템을 이용하여 cloning 함으로써 lentivirus shRNA AIMP2-DX2를 제작하였다.

(나) shRNA AIMP2-DX2의 효율성 검증

제작된 shRNA AIPM2-DX2의 폐암 세포에서의 AIMP2-DX2의 활성 억제 효율을 검증하기 위해 RT-PCR과 단백질 발현양상을 Western blot을 실시하여 확인한 결과, 처리하지 않은 군과 바이러스 대조군을 처리한 군에 비해서 AIMP2-DX2의 활성이 억제되었음을 확인하였다.

구축된 lentivirus 벡터 시스템이 효율적으로 AIMP2-DX2 유전자를 전달하는 것으로 확인할 수 있음을 확인하였으며, 전달된 유전자 AIMP2-DX2의 발현이 억제되는 것을 알 수 있었다.

2. 세포내에서의 shRNA AIMP2-DX2의 항암효과 검증

(가) 폐암 세포주에서의 shRNA AIMP2-DX2의 활성 억제 검증

폐암 세포 주(H46O)에서 shRNA AIMP2-DX2의 활성이 억제되는지를 shRNA AIMP2-DX2가 포함된 lentivirus를 세포에 감염시켜 그 AIMP2-DX2의 활성을 확인한 결과, 10 ng/ml 의 농도로 48 시간 처리할 때 AIMP2-DX2의 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

(나) shRNA AIMP2-DX2 처리에 의한 glucose transporter (GLUT) 발현 양 확인

AIPM2-DX2가 glucose transporter에 미치는 영향을 Western blot를 통해 확인 한 결과, GLUT-1,2,4 가 감소하여 shRNA AIMP2-DX2가 glucose uptake의 속도를 지연시킨다는 것을 알 수 있었다. 또한 O-glycosylation의 영향을 확인하였을 때 shRNA AIMP2-DX2가 O-glycosylation을 억제한다는 결과를 얻었다.

(다) shRNA AIMP2-DX2 처리에 의한 MAPK signaling pathway 관련 단백질 감소

shRNA AIMP2-DX2는 세포 성장에 있어 가장 중요한 에너지원인 glucose transporter에 영향을 주게 되어 glucose의 유입이 감소되고, 감소된 glucose는 EGFR 및 K-ras, ERK1, Mnk1, eIF4E가 포함되는 MAPK signaling pathway 단백질들의 발현양을 감소시키며, 게다가 dual luciferase activity 측정을 통하여 hAIMP2-DX2 shRNA 처리가 cap-dependent 단백질 번역을 감소시킨다는 결과를 얻었다.

3. 폐암 모델 마우스에서의 shRNA AIMP2-DX2의 항암효과 검증

(가) Benzo(α)pyrene 에 의해 유도된 폐암 모델 마우스에서 shRNA AIMP2-DX2 활성 검증

Benzo(α)pyrene에 의해 유도된 폐암 모델 마우스에 shRNA AIMP2-DX2를 에어로졸로 전달한 결과, 대조군, 바이러스 대조군과 비교할 때 lung hyperplasia를 shRNA AIMP2-DX2가 억제하는 것으로 나타났다.

(나) Akt 관련 pathway 에 대한 shRNA AIMP2-DX2의 영향

에어로졸 전달 시스템으로 폐암 모델 마우스에 shRNA AIMP2-DX2를 전달한 결과, phspho-Akt(Thr308)의 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군과 비교할 때 phspho-Akt(Thr308)의 활성에 영향을 주는 PDK1의 활성이 감소하는 것을 확인하였다.

(다) Protein translation, angiogenesis에 대한 shRNA AIMP2-DX2의 영향

에어로졸 전달 시스템으로 폐암 모델 마우스에 shRNA AIMP2-DX2를 전달하였을 때 protein translation관련 단백질(eIF4E, 4E-BP1)의 활성이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, angiogenesis marker로 사용되는 VEGF 단백질 발현양이 대조군, 바이러스 대조군에 비해 감소하는 것을 알 수 있었다.

shRNA AIMP2-DX2는 cancer cell의 성장에 중요한 역할을 하는 Akt의 phosphorylation (Thr308)의 활성을 감소시키고, Akt down stream pathway인 mTOR/p70S6K pathway에 영향을 주었다. 또한 protein translation, angiogenesis와 관련된 단백질의 활성을 감소시키는 결과를 확인하였다.

V. 연구개발결과의 활용계획

본 연구과제는 폐암을 치료하기 위해 유전자를 이용하여 유전자의 변이로 생성되는 폐암을 치료할 수 있는 시스템을 확립하고 치료제 개발이 연구 목적이었다. AIMP2-DX2는 폐암에서 과발현되어 있는 유전자이다. 본 연구에서는 유전자 AIMP2-DX2를 이용, 폐암에서의 그 활성을 억제하여 작용기전을 밝혀 폐암 치료에 응용 할 수 있다는 결과를 얻었다. 하지만, 암 치료에 있어서 유전자 치료 방법은 암세포 뿐만 아니라 정상세포에서도 유전자의 영향을 받게 되어 생기게 되는 부작용이 있으며, 암 치료의 효율성을 극대화 할 수 없다는 단점이 있다. 지난 연구 결과를 바탕으로 하여 암세포만 표적화하여 유전자를 전달할 수 있는 시스템의 구축 및 폐암 치료제를 개발하는데 본 연구 결과를 활용할 것이다. 현재 가장 많은 임상에 사용되고 있고, 벡터의 면역반응을 일이키지 않으며, 전달된 유전자가 표적세포의 유전자에 통합되어 장시간 유전자 발현 가능한 retrovirus 벡터 시스템을 도입한다. 또한 암세포서만 특이적으로 AIMP2-DX2를 발현시키기 위해 cancer specific promoter를 이용하거나 암세포 표면에 binding하여 유전자를 전달할 수 있는 TAG72(tumor-associated glycoprotein 72)란 항체를 도입하여 retrovirus를 이용한 유전자 전달 시스템을 구축한다. 구축된 시스템을 이용하여 AIMP2-DX2 뿐만 아니라 암 치료와 관련된 유전자 (siRNA Akt, CTMP overexpression, LETM1 overexpression)의 crosstalk를 통해 유전자를 먼저, 폐암세포에 전달하여 유전자 전달의 효율성을 검증하고, 암세포의 표적화 정도를 측정하여 표적화된 폐암세포에서 유전자의 작용기전을 검증하여 AIMP2-DX2와 다른 유전자를 동시에 치료에 응용하여 치료함으로써, 단일 유전자를 통한 암세포 치료보다 유전자 치료의 효율성을 높이는데 활용할 수 있을 것이다. 또한 폐암 세포에서의 결과를 바탕으로 폐암 동물 모델에서는 기존의 연구에서 사용되었던 유전자 전달의 방법인 에어로졸을 이용하여 폐로 직접 전달되는 유전자 전달체의 효율성을 높여 유전자를 전달하는데 사용한다. 동물 모델에서 또한 폐암 세포에서의 결과를 활용하여 항암효과를 확인하여 폐암을 치료하기 위한 치료제로써 개발하는데 있어 기존의 AIMP2-DX2의 연구결과를 활용할 것이다. 그리고 폐암뿐만 아니라 다른 암 치료에 있어서 유전자를 이용한 치료 방법에 시스템을 도입하여 유전자 전달의 효율성을 높임으로써 암 치료에 활용할 수 있을 것이다. 그리고 세포 실험 및 동물 실험을 통해 얻은 폐암 치료효과에 대한 자료뿐만 아니라 in vivo에서의 안전성 검증 자료를 바탕으로 하여 구축한 시스템을 임상적으로 이용할 수 있는 방안을 도모하고, 민간 제약 기업등과의 연계를 통하여 전임상실험을 위한 기반 자료로써 활용이 가능할 것이다.