그림 1. 유전자분석 분야가 LMO 위해성 평가에서 차지하는 역할. 13

그림 2. LMO 유전자 분석 기술 시스템 17

제1절 평가대상 LMO 계통의 선발 스크리닝 시스템 개발 26

그림 1. 개발 중인 평가대상 LMO 계통의 선발 스크리닝 시스템 27

그림 2. ABC-TPSP 벼의 개발에 사용된 형질전환 binary vector의 도입유전자 cassette의 구조. 28

그림 3. ABC promoter의 sequence 해명을 위한 primer의 위치 및 sequence. 29

그림 4. RB TPSP F와 RB TPSP R primer 쌍을 사용한 PCR 산물의 agrose gel separation pattern. 29

그림 5. ABC promoter를 발굴하기 위해 direct PCR 법에 의해 TPSP R을 사용하여 sequencing한 결과... 30

그림 6. Sequence of ABC 4 and 6. Completely determined in both directions.... 30

그림 7. NDPK2 벼의 개발에 사용된 형질전환 binary vector의 도입유전자 cassette의 구조. 32

그림 8. NDPK2 binary vector sequence and location of primers used for investigating the integrity of the inserted cassette 33

그림 9. Left border 부위의 도입유전자 cassette 온전성 확인 PCR 산물의 agarose gel 분리 양상.... 38

그림 10. Right border 부위의 도입유전자 cassette의 온전성 확인 PCR 산물의 agarose gel 분리 양상.... 39

그림 11. A2 event의 right border 및 left border 부위의 도입유전자 cassette의 온전성 확인 PCR 산물의 agarose gel 분리 양상.... 40

그림 12. NDPK2 감자의 inverse PCR을 위한 right border 부위의 구조 및 primers. 40

그림 13. NDPK2 감자의 inverse PCR을 위한 left border 부위의 구조 및 primers. 41

그림 14. NDPK 형질전환 event A2-6의 도입유전자의 left border에 대한 inverse PCR 결과 41

그림 15. Event A2의 LB region confirmation PCR.... 44

그림 16. Probe 위치와 primer set.... 45

그림 17. NDPK 감자의 Southern hybridization.... 46

그림 18. NDPK 감자의 Southern Hybridization.... 46

그림 19. Event A2의 left border의 confirmation PCR.... 47

그림 20. 2006년 10월 공급받은 LM 감자의 혼입 유무의 조사를 위한 Actin, NDPK2, NPTII 유전자 특이 PCR 산물의 agarose gel 분리 양상.... 48

그림 21. YHL035c 포플러에 도입된 vector의 구조 49

그림 22. YHL35c 포플러에 도입된 도입유전가 cassette의 sequence 49

그림 23. 도입유전자 온전성 확인을 위한 primer set의 위치 52

그림 24. YHL poplar RB, LB, YHL035c의 온전성 확인 PCR 산물의 agarose gel pattern. 53

그림 25. YHL poplar RB, LB, YHL035c의 온전성 확인 PCR 산물의 agarose gel pattern.... 53

그림 26. YHL035c 포플러의 copy 수 분석을 위한 probe 위치와 primer set 54

그림 27. 도입유전자 cassette상의 35S와 YHL035c 부위에서 제작한 probe YHL1 (a)과 YHL035c 내에서 제작한 probe YHL2 (b, c)로 Southern blotting한 결과.... 55

그림 28. Right border의 flanking sequence를 해명하기 위한 inverse PCR 용 primer의 위치 및 primer sequence. 56

그림 29. Left border의 flanking sequence를 해명하기 위한 inverse PCR 용 primer의 위치 및 primer sequence. 56

그림 30. 16b event의 right border의 flanking sequence의 confirmation PCR 57

그림 31. 17 event의 right border의 flanking sequence의 confirmation PCR 57

그림 32. 17 event의 right border의 flanking sequence의 confirmation PCR 58

그림 33. 18c event의 right border의 flanking sequence의 confirmation PCR 58

그림 34. 19a event의 right border의 flanking sequence의 confirmation PCR 58

Fig. 35. Mx protox 도입유전자 cassette의 구조.... 59

그림 36. Protox 형질전환 벼의 Southern blotting한 결과.... 61

Fig. 37. Inverse PCR을 위한 LB 부위의 구조.... 62

그림 38. Marker free protox 형질전환 벼의 평가 대상 event의 선발 결과에 기초한 수정된 선발 스크리닝 시스템 64

제2절 도입유전자 위치, copy 수 분석 요소기술의 시스템화 및 현장 적용 65

그림 1. ABC-TPSP 형질전환 벼의 도입유전자 copy 수 분석을 위한 Southern blotting.... 66

그림 2. 두개의 도입유전자가 삽입된 양상을 예측하기 위한 PCR 설계 (A) 및 결과 (B) 67

그림 3. PCR을 통해 예측된 두 도입유전자의 인접부위의 sequences (A) 및 도입유전자의 삽입 양상 (B).... 68

그림 4. 도입된 RB와 ABC promoter 부위의 sequence 및 나머지 gene cassette(cassettte)의 sequence. 69

그림 5. ABC rice의 도입유전자 cassette의 RB 부위의 sequence (A, B) 및 인접부위 (A sequence)를 사용한 Blast search 결과 (C). 74

그림 6. Genome walker의 단계별 결과.... 77

그림 7. RB border 및 flanking sequence의 sequencing 결과.... 77

그림 8. Oryza sativa chromosome 3 삽입부위 부근 primer design. 78

그림 9. ABC LB region PCR & 낙동 비교 PCR.... 78

그림 10. ABC-PSP 도입유전자의 left border의 인접 염기서열.... 79

그림 11. ABC 수퍼벼의 세대별 안정성 분석.... 83

그림 12. ABC-TPSP 벼의 도입유전자 cassette 상의 TPP probe의 위치 및 제작에 사용된 primer의 위치. 84

그림 13. ABC 수퍼벼의 세대별 안정성 분석.... 84

그림 14. NDPK2 감자의 inverse PCR을 위한 right border 부위의 구조 및 primers. 85

그림 15. NDPK2 감자의 inverse PCR을 위한 left border 부위의 구조 및 primers. 85

그림 16. The sequence flanking the left end of the inserted NDPK2 cassette. The flanking genomic DNA sequence is italicized. 86

그림 17. Event A2의 LB region confirmation PCR.... 87

그림 18. NDPK2 감자의 도입유전자 cassette의 RB 부위의 sequence.... 88

그림 19. Event A2의 RB flanking sequence의 confirmation PCR.... 89

그림 20. Genomewalker에서 StuI을 사용하여 획득한 sequence의 Genbank EST-others database에 BLAST search한 결과 중 가장 유사성이 높은 토마토 EST에 대한 pairwise alignment. 89

그림 21. NDPK2 도입유전자 위치에서의 대지 감자의 genomic DNA sequence. LB-CONF과 RB-CONF2를 이용하여 PCR한 결과를 sequencing한 결과임. 90

그림 22. Sequence alignment of integration site with deleted genomic DNA.fas 90

그림 23. LB border 의 sequence.... 92

그림 24. RB border의 sequence.... 92

그림 25. 다시 그리는 NDPK potato에 도입된 pCAMBIA2300-NDPK vector의 구조. 93

그림 26. NDPK2 감자의 event-specific quantitative real-time PCR kit의 제작을 위한 primer 및 probe의 위치. 93

그림 27. Probe 위치와 primer set.... 94

그림 28. NDPK2 감자의 Southern hybridization.... 96

그림 29. NDPK2 감자의 Southern Hybridization.... 96

그림 30. 수박 내재유전자 Sat의 Southern Hybridization 100

그림 31. 수박 내재유전자 DIP-1의 Southern Hybridization 100

그림 32. 수박 내재유전자 wrp15a의 Southern Hybridization 101

그림 33. Sat, DIP-1, 및 wrp15a sequence에서 제작한 primer를 사용하여 박과 작물 및 주요 작물에서 PCR한 결과 102

그림 34. 수박 내재유전자 DIP-1 의 multiplex PCR 103

그림 35. 수박 내재유전자 wrp15a의 multiplex PCR 103

그림 36. 박과 작물의 Sat sequence의 sequencing 분석 결과를 바탕으로 제작한 수박 특이성 primer를 사용한 PCR 결과. 104

그림 37. LM 수박공대와 수박공대에서 내재유전자 Sat와 DIP-1에서 제작한 primer 와 LM 수박공대 도입유전자 CGMMV-cp 유전자에서 제작한 primer를 사용한 multiplex PCR 결과. 105

그림 38. PLC 및 CaSIG4 유전자의 copy 수 분석을 위한 Southern blotting.... 106

그림 39. 고추 CaSIG4 cDNA sequence (Genbank accession # AF354454). 107

그림 40. 11개 작물에서의 PCR 108

그림 41. 11개 작물에서의 5' region PCR 109

그림 42/43. 고추 특이적인 내재유전자 115

그림 43/44. 고추 내재유전자 (CaSIG4) Polymorphism Analysis 116

그림 44/45. 고추 내재유전자 (CaSIG4) Polymorphism Analysis.... 117

그림 45/46. PLC 유전자의 cDNA sequence (GenBank accession # AY568589). 117

그림 46/47. 5' region에서 unknown sequence를 포함한 PCR product. 119

그림 47/48. 고추 특이적인 내재유전자 PLC. 120

그림 48/49. 고추 내재유전자 (PLC) polymorphism analysis. 121

그림 49/50. 고추 내재유전자 (PLC) polymorphism analysis.... 121

그림 50/51. 마니따 고추 (PLC) polymorphism analysis. 122

제3절 비의도적 생성 및 소멸 유전자의 발현 여부 확인 기술 시스템의 구축 123

그림 1. Ubi-TPSP 및 ABC-TPSP 형질전환 벼의 잎과 쌀 protein 양을 500ug씩 동일하게 loading한 Western blotting 결과. 124

그림 2. E. coli TPSP 의 thrombin 처리.... 124

그림 3. drought stress를 준 NDPK 감자의 단백질 발현 125

그림 4. drought stress를 준 NDPK 감자 단백질의 Coomasie Blue 염색. 126

그림 5. Cold stress를 준 NDPK 감자의 단백질 발현 126

그림 6. Human nm23-H1 protein에서 제작한 NDPK2 항체를 cold stress를 준 NDPK2 감자의 단백질에 western blotting한 결과. 127

그림 7. NDPK2 감자 잎의 단백질에서 NDPK2 단백질의 western blotting. 128

그림 8. NDPK2 감자 잎의 단백질에서 NDPK2 단백질의 western blotting에 사용한 그림 2의 blot을 Coomassie Blue를 사용하여 염색한 결과 128

그림 9. NDPK2 감자 잎의 단백질에서 NDPK2 단백질의 western blotting. 129

그림 10. ABC-TPSP 형질전환 벼의 도입위치에서 비의도적 유전자 생성 또는 소멸 유전자 발현 조사 scheme 130

그림 11. Capillary transfer 모식도. 131

그림 12. 표 2의 solution을 이용한 membrane transfer 확인 132

그림 13. ABC-TPSP 형질진환 벼에서 비의도적 유전자의 발현을 조사하기 위한 northern hybridization.... 133

그림 14. ABC-TPSP 형질전환 벼에서 비의도적 유전자의 발현 조사하기 위한 northern hybridization.... 134

그림 15. ABC-TPSP 벼 및 낙동벼의 RT-PCR 결과.... 137

그림 16. 대서 감자 (W) 및 NDPK2 감자 (L) 의 RT-PCR 결과.... 139

제4절 DNA 기초 event specific 정성 및 정량 분석법 개발 141

그림 1. Event-specific multiplex PCR using primer pairs designed from the right end at the integration site of ABC-TPSP transgenic rice. 141

그림 2. Event-specific multiplex PCR using primer pairs designed from the left end at the integration site of ABC-TPSP transgenic rice.... 142

그림 3. LM 수박공대와 수박공대에서 내재유전자 Sat와 DIP-1에서 제작한 primer 와 LM 수박공대 도입유전자 CGMMV-cp 유전자에서 제작한 primer를 사용한 multiplex PCR 결과. 143

그림 4. 고추, 감자, 토마토의 CaSIG4 유전자의 genomic DNA 절편 염기서열의 배열. 144

그림 5. 감자 SIG4 유전자 염기서열에서 제작한 primer쌍을 사용한 감자특이 PCR 산문의 agarose gel 분리 양상.... 145

그림 6. NDPK2 감자의 left border 삽입 염기서열과 감자 내재유전자 SIG4로부터 제작된 프라이머쌍을 이용한 NDPK2 특이적 multiplex PCR을 수행한 결과.... 146

그림 7. 대전 H 대형 할인 매장에서 샘플링한 대두를 포함하는 가공식품의 PCR분석 결과. 149

그림 8. 대전 K 대형 할인 매장에서 샘플링한 대두를 포함하는 가공식품의 PCR분석 결과. 150

그림 9. 서울 S 백화점에서 샘플링한 대두를 포함하는 가공식품의 PCR분석결과. 151

그림 10. 위의 대두를 포함하는 가공식품에서 검출된35S promoter PCR 반응물의 염기서열 분석결과 및 BLAST Search 결과. 152

그림 11. 대두를 포함하는 가공식품들 중 LM으로 추정되는 sample들의 도입유전자 특이 primer를 이용한 재검정 결과. 153

그림 12. 전 K 대형 할인 매장에서 샘플링한 대두를 포함하는 가공식품의 도입유전자 특이 primer를 이용한 PCR 분석결과. 153

그림 13. 서울 S 백화점에서 샘플링한 대두를 포함하는 가공식품의 도입유전자 특이 primer를 이용한 PCR 분석 결과. 154

그림 14. 대전 H 대형 할인 매장에서 샘플링한 대두를 포함하는 가공식품의 가공식품용 LFS(Trait RUR Toasted Meal Test Kit)로 분석한 결과. 155

그림 15. 대전 K 할인매장에서 샘플링한 대두를 포함하는 가공식품의 가공식품용 LFS(Trait RUR Toasted Meal Test Kit)로 분석한 결과. 156

그림 16. 서울 S 백화점에서 샘플링한 대두를 포함하는 가공식품의 가공식품용 LFS(Trait RUR Toasted Meal Test Kit)로 분석한 결과. 157

그림 17. 대전 HE 대형 할인 매장에서 샘플링한 콩을 포함하는 가공식품의 PCR분석 결과.... 159

그림 18. 대전 HE 할인 매장의 samples 중 두부류에 대하여 denature된 CP4 EPSPS protein을 확인하기 위한 Trait RUR TM strip test 결과. 160

그림 19. 청주 HP 대형 할인 매장에서 샘플링한 콩을 포함하는 가공식품의 PCR분석 결과.... 163

그림 20. 청주 할인 매장 samples 중 두부류에 대하여 denature된 CP4 EPSPS protein을 확인하기 위한 Trait RUR TM strip test 결과 164

그림 21. 청주 L 마트 매장에서 샘플링한 콩을 포함하는 가공식품의 Lectin, 35S promoter, rot terminator, cp4-epsps DNA sequence의 PCR 증폭 결과.... 166

그림 22. 예상되는 크기의 PCR 산물의 band의 염기서열의 알려진 염기서열과의 alignment 결과. 166

그림 23. 청주 L 마트 매장의 samples 중 32번-38번 콩나물류 제품의 lateral flow strip test 결과. 168

그림 24. 청주 H 마트 매장에서 샘플링한 콩을 포함하는 가공식품의 Lectin, 35S promoter, nor terminator, cp4-epsps DNA sequence의 PCR 증폭 결과.... 170

그림 25. Lectin의 표준곡선과 ct값에 따른 증폭곡선 174

그림 26. CP4EPSPS의 표준곡선과 ct값에 따른 증폭곡선 175

그림 27. Evaluation of the contamination of various commercial Taq polymerases.... 178

그림 28. Evaluation of the contamination of various commercial Taq polymerases.... 179

그림 29. The decontamination of antibiotic resistance genes in Taq polymerase.... 179

제5절 환경 스트레스 내성 LMO의 신속면역 분석법 개발 180

Fig. 1. Procedure of total protein extraction from rice and rice leave samples. 183

Fig. 2. Procedures of indirect ELISA for the detection of TPSP protein. 185

Fig. 3. Result of SDS-PAGE for TPSP expression.... 187

Fig. 4. Result of SDS-PAGE for TPSP protein purification by Ni²-NTA agarose column chromatography.... 188

Fig. 5. Result of mice blood antisera titer test.... 188

Fig. 6. The ELISA result for detection of polyclonal antibody antigen binding affinity. 189

Fig. 7. ELISA results for test of the polyclonal antibody binding to protein extracted form rice samples. R-TPSP is purified recombinant TPSP protein; TR-Protein is protein extracted from transgenic rice; W-protein is protein extracted from wide rice. 190

Fig. 8. Result of western blot using antibodies in cell culture medium from 16 different hybridoma cell lines.... 191

Fig. 9. The SDS-PAGE results for assay the purity of purified mAb.... 192

Fig. 10. The ELISA result for detection of monolonal antibodies antigen binding affinity.... 192

Fig. 11. Western blot result for detection of specificity of mAb 3G6-1.... 193

Fig. 12. Result of SDS-PAGE of rice total protein extracted by six different methods.... 194

Fig. 13. Agarose gel electrophoresis of pRTPSP plasmid.(그림없음) 194

Fig. 14. Result of PCR amplification of TPP gene.... 194

Fig. 15. Colony PCR for detection of recombinant pET 22b-TPS and pET 22b-TPP.... 195

Fig. 16. SDS-PAGE of recombinant TPP and TPS protein expression Lane 1, whole cell lysate of E. coli for expressio of TPP: lane 2,soluble fraction of cell lysate E, coli for expression of TPP: lane 3, insoluble fraction of cell lysate E. coli for expression of TPP: lane 4, whole cell lysate of E.coli for... 196

Fig. 17. SDS-PAGS of recombinant TPP and TPS protein expression with optimal conditions.... 196

Fig. 18. Electrophoresis for detection of enzyme treated pET 22b-TPS and pET 26-TPS plasmids.... 197

Figure 19. SDS-PAGE of recombinant TPS protein expression.... 198

Fig. 20. SDS-PAGE of purification of TPS recombinant protein by Ni²+(이미지참조)-agarose.... 199

Fig. 21. ELISA titration of immunized mouse TPS antiserum.... 199

Fig. 22. Screening of hybridoma cells producing antibody toward TPSP protein. 201

Fig. 23. Comparison of PBS and carbonate buffer as coating buffer. 202

Fig. 24. Determination of coating time and temperature on indirect ELISA 202

Fig. 25. Determination of skim milk concentration for reduction of non-specific binding in indirect ELISA. 203

Fig. 26. Effect of blocking time and temperature on indirect ELISA 203

Fig. 27. Determination of antibody dilution times on indirect ELISA. 204

Fig. 28. Effect of temperature on indirect ELISA. 204

Fig. 29. Standard curve for detection of TPSP protein by indirect ELISA 205

제6절 형질 전환 표지 유전자 제거 기술의 벼 현장 적용 206

그림 1. Selection marker cassette binary vector(pHC) and minimal binary vector for the target gene(pHA) 207

그림 2. 애기장대 ABF3의 cDNA서열(A)과 아미노산 서열(B). 209

그림 3. pHA벡터 제작과정. 210

그림 4. ABF3를 과다 발현하는 벡터의 제한효소 절단에 의한 전기영동 양상. 211

그림 5. Selection marker cassette를 가진 binary vector의 제작의 모식도. 212

그림 6. pHC 벡터를 제한 효소로 절단한 전기영동상 213

그림 7. 벼의 형질전환 과정 모식도 214

그림 8. 벼의 형질전환용 callus 유도 214

그림 9. 재분화가 이루어진 형질전환체 벼의 순화 및 포트이식 215

그림 10. PCR기법을 이용한 co-transformation 확인... 216

그림 11. 5-FC를 이용한 negative selection 조건 탐색 216

그림 12. 5-FC(2g/L)를 벼의 생존 실험 216

그림 13. Southem blot을 통해 co-transformation된 벼의 확인(BamHI digestion) 217