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보고서 초록
요약문
SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 12
제1절 연구개발의 목적 12
제2절 연구개발의 필요성 12
제3절. 연구개발의 범위 17
제2장 국내외 기술개발 현황 19
제1절 항생물질 생합성 유전자의 조합을 통한 미생물 재설계 연구 19
제2절 PKS 유전자에 관한 연구 20
제3절 Deoxysugar 생합성 유전자에 관한 연구 22
제4절 Polyketide 생합성 유전자의 조합을 통한 신규 미생물 대사산물 창출 24
제5절 방선균에서의 PCR-targeting system을 이용한 유전자 조작 기술 28
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 31
제1절 유전자 증폭에 의한 PKS module cassette의 제조 31
제2절 Homologous recombination에 의한 PKS module cassette 제조 39
제3절 Homologous recombination에 의한 PKS module 유전자 삭제 47
제4절 Module 3 deletion mutant로부터 생산된 항생물질의 분리 확인 54
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 59
제1절 목표달성도 59
제2절 관련분야의 기술발전에의 기여도 60
제5장 연구개발결과의 활용계획 62
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 63
제7장 참고문헌 66
표 1. 현재 의약품으로 이용되는 미생물 이차대사산물들 16
표 2. Dihydrochalocmycin PKS 유전자의 module 확보를 위한 유전자 증폭용 primer의 염기서열 32
표 3. 증폭된 각 module cassette 내 변형된 염기 수 39
표 4. Homologous recombination에 의해 dihydrochalcomycin PKS의 각 module cassette를 제조하기 위한 primer 및 template DNA 43
그림 1. Dihydrochalcomycin 생합성에 관여하는 PKS 유전자의 module과 이에 의해 생합성되는 macrolactone의 위치 18
그림 2. Erythromycin 생합성 유전자 중 polyketide synthase 유전자 module들 21
그림 3. Type I polyketide synthase에 의해 polyketide 쇄가 신장하는 과정 22
그림 4. 미생물 이차대사산물에 존재하는 deoxysugar 영역들 23
그림 5. Erythromycin PKS 유전자의 loading module을 avermectin PKS의 loading module과 교체하여 새로운 erythromycin 유도체를 생산하는 방법 25
그림 6. Erythromycin PKS 유전자의 module domain을 삭제하거나 불활성화하여 제조된 미생물 대사체들.... 25
그림 7. Precursor를 공급한 화학생합성법(Chemo-Biosynthesis)에 의한 polyketide 생산 방법. 26
그림 8. 여러 PKS 유전자들의 3개 module을 임의 조합하여 생성된 triketide lactone 화합물들 27
그림 9. 방선균에서 유전자 불활성화를 위해 개발된 PCR-targeting in frame deletion 방법 29
그림 10. Dihydrochalocmycin PKS 유전자의 module 확보를 위해 1 kb 크기 내외의 유전자 조각들을 증폭하기 위한 전략 31
그림 11. 증폭된Loading Module의 유전자조각들... 34
그림 12. 증폭된Module1의유전자조각... 34
그림 13. 증폭된Module2의유전자조각... 35
그림 14. 증폭된Module3의유전자조각... 35
그림 15. 증폭된Module4의유전자조각... 35
그림 16. 증폭된Module5의유전자조각... 35
그림 17. 증폭된Nodule6의유전자조각... 36
그림 18. 증폭된Module7의유전자조각... 36
그림 19. pET28a 운반체에 구축된 loading module 유전자의 확인... 37
그림 20. pET28a 운반체에 구축된 module 1 유전자의 확인... 37
그림 21. pET28a 운반체에 구축된 module 2 유전자의 확인... 37
그림 22. pET28a 운반체에 구축된 module 7 유전자의 확인... 37
그림 23. E. coli BL21(DE3)에서 발현된 loading module 유전자 산물... 38
그림 24. E. coli BL21(DE3)에서 발현된 module 1 유전자 산물... 38
그림 25. E. coli BL21(DE3)에서 발현된 module 2 유전자 산물... 38
그림 26. Homologous recombination에 의한 module cassette를 제조하기 위한 운반체 구축 40
그림 27. Homologous recombination에 의한 module cassette를 제조하기 위해 구축한 운반체의 확인... 41
그림 28. λRed system을 이용한 homologous recombination에 의해 dihydrochaicomycin PKS의 각 module cassette를 제조하기 위한 전략 42
그림 29. Homologous recombination 하기 위해 loading module 및 module 1의 upstream 및 downstream 부위를 도입한 SuperCos-YU-LM/M1의 확인... 44
그림 30. Homoiogous recombination 하기 위해 module 2의 upstream 및 downstream 유전자를 도입한 SuperCos-YU-M2의 확인... 44
그림 31. Homologous recombination 하기 위해 module 3의 upstream 및 downstream 유전자를 도입한 SuperCos-YU-M3의 확인... 45
그림 32. Homologous recombination 하기 위해 module 4의 upstream 및 downstream 유전자를 도입한 SuperCos-YU-M4의 확인... 45
그림 33. Homologous recombination 하기 위해 module 5의 upstream 및 downstream 유전자를 도입한 SuperCos-YU-M5의 확인... 45
그림 34. Homologous recombination 하기 위해 module 6의 upstream 및 downstream 유전자를 도입한 SuperCos-YU-M6의 확인... 45
그림 35. Homologous recombination 하기 위해 module 7의 upstream 및 downstream 유전자를 도입한 SuperCos-YU-M7의 확인... 46
그림 36. Homologous recombination에 의해 확보된 loading module 및 modulo 1 유전자의 확인... 46
그림 37. Homologous recombination에 의해 확보된 module 2 유전자의 확인... 46
그림 38. Homologous recombination에 의해 확보된 module 3 유전자의 확인... 46
그림 39. Homologous recombination에 의한 module 3 및 module 4의 유전자를 in-frame 삭제하기 위한 deletion cassette의 구축 48
그림 40. Homologous recombination에 의한 module 3 및 module 4의 유전자를 in frame 삭제하기 위해 구축한 deletion cassett의 확인... 49
그림 41. PCR targeting에 의해 module 3 또는 module 4 유전자의 deletion cassette를 지닌 PHZ1351-△module 3(△module 4) aad)의 확인... 49
그림 42. Module 3 (또는 module 4) 유전자의 deletion cassette를 지닌 E. coli ET12567/pU28002와 dihydrochalcomycin 생산균주인 Streptomyces sp. GERI-155와의 접합을 통한 module 3 (또는 module 4) 유전자의 삭제 50
그림 43. Module 3 (또는 module 4) 유전자가 삭제된 Streptomyces sp. GERI-155의 항생물질 감수성 확인 51
그림 44. Module 3 (또는 module 4) 유전자가 삭제된 Streptomyces sp. GERI-155의 염색체 DNA내 유전자 삭제 여부를 PCR로 유전자 증폭하여 확인한 결과... 51
그림 45. E. coli DH5a/BT340 균주에서 module 3 (또는 module 4) 유전자를 FLP-mediated in-frame deletion 시킨 plasmid의 선별... 52
그림 46. Module 3 또는 module 4 유전자가 삭제된 Streptomyces sp. GERI-155의 disruptant 내에서 aad 및 oriT 유전자를 in-frame deletion시켜 최종적으로 14환의 macrolide 항생물질 생산균주를 구축하는 과정 53
그림 47. Module 3 및 module 4 deletion mutant 배양액의 항균 활성... 54
그림 48. Module 3 disruptant로부터 생산된 Ketolide 항생물질 분리 과정 55
그림 49. Module 3 disruptant에 의해 생산된 항균물질의 RP-18 column을 이용한 HPLC 분리 양태 56
그림 50. TLC를 이용한 module 3 disruptant로부터 생산된 Ketolidc 항생물직의 확인... 56
그림 51. Module 3 disruptant에 의해 생산된 항균물질의 항균활성... 56
그림 52. Module 3 disruptant에 의해 생산된 항균물질의 화학적 구조... 57
그림 53. Module 3 disruptant에 의해 생산된 항균물질의 mass spectrometer 분석 자료 58
그림 54. 방선균의 polyketide synthase 유전자 조합을 통한 신규 항생물질 개발에 관련된 특허맵 63
그림 55. Polyketide synthase 유전자의 조합 생합성을 통한 신규 항생물질 생산에 관련된 특허상의 기술발전도 65
원문구축 및 2018년 이후 자료는 524호에서 직접 열람하십시요.
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