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보고서 초록

요약문

SUMMARY

CONTENTS

목차

제1장 연구개발과제의 개요 20

제1절 연구개발의 목적 20

제2절 연구개발의 필요성 및 범위 22

1. 기술적 측면 23

2. 생태·환경·사회·문화적 측면 24

3. 연구의 범위 25

제2장 국내외 기술개발 현황 28

제1절 국내외 연구개발 현황 28

제2절 난배양성 미생물 배양기술의 현황 29

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 32

제1절 해수환경에서 난배양 미생물 고효율배양 32

1. 미생물 고효율배양 연구 방법 32

가. 연구지역 및 시료채취 32

나. 일반 평반배지를 이용한 미생물의 배양 32

다. 희석·소멸법에 기초한 고효율 배양기법을 통한 미생물의 분리 35

(1) 해수기반 배양배지의 제작 35

(2) 희석-소멸법에 의한 해수의 희석 및 접종, 배양 35

(3) 형광현미경 관찰을 위한 slide의 제작과 형광현미경 탐색 35

(4) 배양액의 회수와 순수배양을 통한 분리 36

라. 16S rDNA를 이용한 미생물의 계통학적 분석 38

(1) Genomic DNA의 추출 38

(2) 16S rDNA 증폭과 정제 38

(3) 제한효소 절편 다형성 분석 (restriction fragment length polymorphism ; RfLP) 40

(4) 16S rDNA 염기서열 분석 및 계통도 작성 40

마. 배양된 해양 Gammmaproteobacteria의 생장 특성 분석 42

2. 해수미생물 배양 결과 45

가. 저가형 고효율배양기법 확립 및 해양빈영양 미생물의 배양 45

(1) 희석-소멸법의 개요 45

(2) 희석-소멸법의 확립 46

(3) 용존 탄소 농도에 따른 고효율 배양기법의 배양성 비교 50

(4) 희석·소멸을 통한 배양액에서의 콜로니 형성 여부 53

(5) 미세콜로니(Micro-colony)의 관찰 56

(6) 콜로니 형성 균주의 16S rDNA 염기서열 및 계통학적 분석 58

(7) 배양된 해양 Gammaproteobacteria의 생장 특성 64

(가) 대표 균주의 선정 64

(나) 선정 균주의 생장 특성 66

(다) 선정 균주의 비특이적 생장률(μ)의 차이 69

(라) 선정 균주의 생장곡선 73

나. 배양된 미생물의 다양성 및 균주의 기탁 77

(1) 총 배양된 미생물의 수, 신종 후보의 수, 균주의 기탁 77

(2) 배양된 미생물의 분자계통학적 다양성 93

제2절 해양무척추동물 및 갯벌에서 미생물 분리 99

1. 연구 배경 99

2. 연구 방법 101

가. 시료의 채취 및 운반 101

나. 해양무척추동물 공생 미생물 및 갯벌퇴적물에서의 미생물 분리 103

다. 분자계통학적 분석 105

(1) 핵산의 추출 105

(2) 16S rDNA 증폭 105

(3) 제한효소절편 길이 다형성(RFLP) 106

(4) 염기서열 분석 및 계통학적 분석 106

3. 연구 결과 및 고찰 107

가. 배양가능 세균군집의 분석 107

(1) 배양 및 분리된 균주의 수 107

(2) 16S rDNA 염기서열의 유사도 분석 109

(3) 16S rDNA에 기초한 분자계통학적 분석 109

(가) 갯지렁이 소화관에서 분리된 세균 109

(나) 갯벌 퇴적물에서 분리된 세균 117

(다) 갯지렁이 소화관 및 갯벌 퇴적물의 배양가능 세균군집 비교 123

제3절 배양균주의 다상분류 136

1. 연구배경 136

2. 연구방법 137

가. 신분류군의 다상분류 137

(1) 분자유전학적 분석 137

(2) 형태-표현형질에 따른 분석 138

(가) 세포 형태 관찰 138

(나) 물리적 성장 요인에 따른 배양상태 관찰 138

(다) 생리-생화학적 특징 및 세포 구성물질 분석 138

3. 완료된 다상분류 (투고 혹은 투고예정) 145

가. 해양 빈영 양성 Gammaproteobacteria의 다상분류 145

(1) 형태 및 기본 생리 특성 145

(가) 미생물의 형태 관찰 145

(나) 물리적 성장요인에 따른 배양 관찰 146

(다) 기본 생리 특성 관찰 150

(2) 생화학적 특성 154

(3) 계통학적 분석 154

(가) IMCC2047 균주의 계통학적 분석 155

(나) IMCC2115 균주의 계통학적 분석 157

(다) IMCC2136 균주의 계통학적 분석 159

4. 다상분류를 통해 공식 등록된 미생물 161

가. IMCC1616의 다상분류 ; Lutimonas vermicola gen. nov., sp. nov. 161

나. 그 외 공식 등록된 미생물의 종합적인 고찰 167

(1) IMCC1914 ; Gaetbulibacter marinus sp. now. 167

(2) IMCC1877 ; Marinobacterium litorale sp. nov. 171

(3) IMCC1545 ; Puniceicoccus vermicola sp. nov. 175

(4) IMCC1001 ; Sufflavibacter maritimus sp. nov. 178

(5) HTCC2601 ; Pelagibaca bermudensis sp. nov. 182

(6) IMCC2654 ; Maritimibacter alkaliphilus gen. nov., sp. nov. 186

(7) IMCC2662, IMCC2663 ; Ruegeria pelagia sp. nov. 190

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 194

제1절 연구목표 및 연구내용 194

1. 연구개발의 최종목표 194

2. 연차별 연구개발 목표 및 내용 194

제2절 연구목표 및 평가착안점에 근거한 목표 달성도 195

제3절 연구개발성과 현황 198

1. 종합 성과물 목록 198

2. 연구논문 발간 현황 198

3. 학술회의 발표실적 200

제5장 연구개발결과의 활용계획 204

제1절 연구개발결과의 대표적 성공사례 204

1. 연구개발성과의 질적 우수성 204

2. 대표적 연구개발성과 205

가. 해수 서식 미생물 및 해양무척추동물과 상호작용하는 미생물의 희석-소멸법을 이용한 성공적 확보 205

나. 갯지렁이의 소화관에서 해양세균 중 최초로 Verrucomicrobia 문에 속하는 세균 분리 및 새로운 목(order)의 등록 205

다. SAR116, RCA cluster, OM75, CHABIII-7 등 비배양 해양군집에 속하는 미생물의 최초 배양 및 광생산 기작의 탐색 206

라. 갯지렁이 소화관 및 해양에서 신 분류군의 국제적인 등록 및 논문 발간 207

마. 해양에서 빈영양성 콜로니 생성세균의 계통학적 추적 및 생리적 연구 207

제2절 연구개발결과의 활용계획 208

1. 연구개발성과의 응용잠재력 및 사업화시의 활용가능성 208

가. 기술적 응용잠재력 208

나. 사업화로서의 활용가능성 208

다. 연구개발성과의 산업·공공분야 파급효과 209

(1) 산업분야 209

(2) 공공분야 209

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 210

제7장 참고문헌 212

List of Table

Table 1-1-1. Purpose of this study throughout the research period. 21

Table 1-2-1. Research scope and specific contents of research and development. 27

Table 3-1-1. Composition of agar media used for cultivation studies. 34

Table 3-1-2. Composition of PCR reaction buffer used for the amplification of 16S rRNA gene. 39

Table 3-1-3. Primer sequences and positions used for 16S rDNA amplification and sequencing analyses. 41

Table 3-1-4. Chemical composition of Cyano Trace Metal Solution. 43

Table 3-1-5. Chemical composition of vitamin solutions. 44

Table 3-1-6. Culturability in HTC with different DOC concentrations 51

Table 3-1-7. Number of colony-formers among the dilution-to-extinction cultures. 55

Table 3-1-8. Number of isolates identified by PCR-RFLP-sequencing and summary of phylogenetic analyses. 60

Table 3-1-9. Summary of comparative 16S rRNA gene analyses showing the nearest neighbors to IMCC isolates. 61

Table 3-1-10. 16S rDNA sequence similarities among the IMCC isolates. 65

Table 3-1-11. Growth characteristics of the representative IMCC isolates in the Gammaproteobacteria. 68

Table 3-1-12. Summary of total number of bacterial isolates during three years of research. 78

Table 3-1-13. The list for strains deposited in culture collections. 80

Table 3-2-1. Number of total isolates and 16S rDNA-sequenced isolates. 108

Table 3-2-2. Summary of novel bacterial taxa obtained from digestive tracts of a marine polychaeta obtained in 2005 and 2007. 111

Table 3-2-3. Summary of novel bacterial taxa obtained from tidal flat sediments in 2005 and 2007. 119

Table 3-2-4. List of isolated strains from tidal sediments and marine polychaeta. 127

Table 3-3-1. Composition of Artificial seawater used in this study. 141

Table 3-3-2. API 20NE test lists for bacterial biochemical activities. 142

Table 3-3-3. API ZYM test lists for enzyme activities. 143

Table 3-3-4. List of carbon sources for BIOLOG GN2 microplate test. 144

Table 3-3-5. An example of polyphasic taxonomy 147

Table 3-3-6. Phenotypic and growth characteristics of some IMCC strains chosen for polyphasic taxonomy. 149

Table 3-3-7. Results of sole carbon source utilization tests. 151

Table 3-3-8. Susceptibility to various antimicrobial agents in strains IMCC2047, IMCC2115, and IMCC2136. R, resistant ; S, susceptibility. 152

Table 3-3-9. Differential phenotypic characteristics of strain IMCC1616T and other related genera in the family Flawobacteriaceae. 165

Table 3-3-10. Differential phenotypic characteristics between strain IMCC1914T(이미지참조) and G. saemankumensis 170

Table 3-3-11. Characteristics that differentiate strain IMCC1877T(이미지참조) from type strains of Marinobacterium species 174

Table 3-3-12. Characteristics that differentiate strain IMCC1545T(이미지참조) from other members of subdivision 4 of the 'Verrucomicrobia' 177

Table 3-3-13. Phenotypic characteristics Sufflavibacter maritimus and closely relative genera in the family Flavobacteriaceae. 181

Table 3-3-14. Characteristics that differentiate strain HTCC2601T(이미지참조) from members of the phylogenetically related genera Salipiger and Palleronia. 185

Table 3-3-15. Differential characteristics of strain HTCC2654T(이미지참조) and other related taxa within the Roseobacter clade 189

Table 3-3-16. Characteristics that differentiate Strain HTCC2662T(이미지참조) from members of the genus Ruegeria 193

List of Figure

Fig. 1-2-1. Schematic diagram of research 26

Fig. 3-1-1. Geographical maps showing location of the sampling sites, especially for the Yellow Sea samples. 33

Fig. 3-1-2. Schematic diagram of high-throughput culturing (HTC) procedures based on dilution-to-extinction. 37

Fig. 3-1-3. The schematic diagram of high throughput culturing method based on dilution-to-extinction 47

Fig. 3-1-4. Photographs of cell arrayer (A), filtering device (B), and air-sparging device (C). 48

Fig. 3-1-5. Dilution-to-extinction culturing combined with microcolony observation 49

Fig. 3-1-6. Comparison of culturability in HTC with different culture media showing that LNHM + CM culture media is superior to LNHM in culturing marine bacteria. 52

Fig. 3-1-7. The percentage of colony-forming bacteria compared with a total of grown extinction cultures. 54

Fig. 3-1-8. Micrographs of colony morphology of strain IMCC2115 taken with a Stereoscopic microscope.... 57

Fig. 3-1-9. Percentage of major bacterial classes/phyla containing cultivated IMCC isolates. 62

Fig. 3-1-10. Neighbor-joining 16S rRNA gene-based phylogenetic tree showing relationships between the IMCC isolates and related environmental clone sequences in the domain Bacteria.... 63

Fig. 3-1-11. Epifluorescence micrographs of DAPI-stained initial phase(uppercase letters) and exponential phase(lowercase letters) cells of the IMCC isolates in the Gammaproteobacteria.... 67

Fig. 3-1-12. Specific growth rates(μ) determined by regression analysis based on the growth curve experiment of strain IMCC2061.... 71

Fig. 3-1-14. Growth curves of (a) obligate oligotroph(IMCC2047) and (b) facultative oligotroph(IMCC2057). 75

Fig. 3-1-15. Growth curves of facultative oligotrophs (a) IMCC2115, (b) IMCC2143. 76

Fig. 3-1-16. The categorization of demarcating novel bacterial genera and species. 79

Fig. 3-1-17. Phylogenetic tree that show relationships between IMCC isolates and members of the Alphaproteobacteria 94

Fig. 3-1-18. Phylogenetic tree that show relationships between IMCC isolates and members of the SARl16 clade. 95

Fig. 3-1-19. Phylogenetic tree that show relationships between IMCC isolates and members of the RCA cluster. 96

Fig. 3-1-20. Phylogenetic tree that show relationships between IMCC isolates and members of the Gammaproteobacteria. 97

Fig. 3-1-21. Phylogenetic tree that show relationships between IMCC isolates and members of the Bacteroidetes. 98

Fig. 3-2-1. Map of sampling area and sampling site located in Donggeom island(37˚34'79N, 126˚30'95E). 102

Fig. 3-2-2. Schematic diagram of experimental procedures for bacterial isolation,165 rDNA analyses, and polyphasic taxonomy. 104

Fig. 3-2-3. Phylogenetic composition of colony forming bacteria isolated from digestive tracts of a marine polychaeta in 2005 and 2007. 110

Fig. 3-2-4. Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences obtained from bacterial isolates in digestive tracts of marine polychaeta. 116

Fig. 3-2-5. Phylogenetic composition of colony forming bacteria isolated from tidal flat sediments in 2005 and 2007. 118

Fig. 3-2-6. Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of bacterial isolates retrieved from tidal flat sediments.... 122

Fig. 3-2-7. Comparison of phylogenetic composition between the isolates from marine polychaeta and from tidal sediments in 2005 and 2007 study.... 125

Fig. 3-2-8. Comparison of polychaeta-specefic and sediment-specific bacterial isolates. 126

Fig. 3-3-1. Epifluorescence micrograaphs (uppercase letters) and transmission electron micrographs (lowercase letters) of strains IMCC2047(A, a), IMCC2115(B, b), and IMCC2136(C, c). 153

Fig. 3-3-2. Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing distant relationships between strain IMCC2047T(이미지참조) and representatives of the class Gammaproteobacteria.... 156

Fig. 3-3-3. Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing distant relationships between strain IMCC2115T(이미지참조) and representatives of the class Gammaproteobacteria.... 158

Fig. 3-3-4. Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing distant relationships between strain IMCC2136T(이미지참조) and representatives of the class Gammaproteobacteria.... 160

Fig. 3-3-5. Epifluorescence micrograph (A) and transmission electron micrograph (B) showing the cell morphology of strain IMCC1616T(이미지참조) 164

Fig. 3-3-6. Neighbour-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing relationships between strain IMCC1616T(이미지참조) and representatives of the family Flavobacteriaceae.... 166

Fig. 3-3-7. (a) Neighbour-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing relationships between strain IMCC1914T(이미지참조) and representatives of the family Flavobacteriaceae.... 169

Fig. 3-3-8. Neighbour-joining 16S rRNA gene phylogenetic tree showing relationships among Strain IMCC1877T(이미지참조), Marinobacterium Species and representatives of the order Oceanospirillales.... 173

Fig. 3-3-9. (a) Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences, showing relationships between strain IMCC1545T(이미지참조) and representatives of the phylum 'Verrucomicrobia'.... 176

Fig. 3-3-10. Phylogenetic tree based on nearly complete 16S rRNA gene sequences... 180

Fig. 3-3-11. Neighbour-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing relationships between strain HTCC2601T(이미지참조) and representatives of the order Rhodobacterales. 184

Fig. 3-3-12. (a) Neighbour-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing the relationships between strain HTCC2654T(이미지참조) and representatives of the order Rhodobacterales.... 188

Fig. 3-3-13. (a) Neighbour-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing the relationships between strains HTCC2662T(이미지참조) and HTCC2663 and members of the order Rhodobacterales.... 192

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