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보고서 초록
요약문
SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 12
1. 연구개발의 필요성 12
가. 경제, 산업적 측면의 필요성 12
나. 기술적 측면의 필요성 12
2. 연구개발의 목적 13
가. 연구개발의 최종목표 13
나. 연구개발의 단계별 목표 및 내용 13
제2장 국내외 기술개발 현촹 17
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 18
1. 1차년도 연구내용 및 결과 18
2. 2차년도 연구내용 및 결과 22
3. 3차년도 연구내용 및 결과 29
4. 4차년도 연구내용 및 결과 39
제4장 목표달성도 및 관련분야 기여도 52
1. 1차년도 목표달성도 52
2. 2차년도 목표달성도 53
3. 3차년도 목표달성도 54
4. 4차년도 목표달성도 55
제5장 연구개발결과의 활용계획 58
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 59
제7장 참고문헌 59
table 1. GAL-4-based yeast two-hybrid system was used to identify the protein that interacts with HGTD-P protein.... 23
table 2. HGTD-P를 과발현 시킨 후 cDNA microarray를 시행하였다.... 27
1차년도 연구내용 및 결과 18
그림 1. BNip3, membrane anchor domain이 없는 BNip3ΔTM, BH3 domain이 없는 BNip3ΔBH3, BNip3의 membrane anchor domain을 Bcl-2의 membrane anchor domain으로 치환한 BNip3-Bcl2TM, rat의 cytochrome b5로 치환한 BNip3-Cyb5TM을 제작하였다. 18
그림 2. 변이형 유전자를 세포에 주입하여 발현 양상을 미토콘드리아 표식자인 hsp60과 비교, 확인 하였으며 (왼쪽) 세포를 회수하여 lysate를 얻은 후 항 HGTD-P 항체로 immunoprecipitation을 시행하였다. 18
그림 3. Bcl-XL에서 BH4 domain이 없는 변이형을 제작하여 (위) 유전자를 주입한 후 immunoprecipitation을 시행 한 결과 BH4 domain이 없는 변이형은 HGTD-P와 결합하지 못하였다 (아래) 19
그림 4. HGTD-P를 단독으로 주입하거나 Bcl-XL, Bcl-XLΔBH4와 병합하여 주입 한 후 세포사멸의 정도를 DAPI 염색하여 관찰하였다.... 19
그림 5. BNip3는 세포사멸 신호가 들어오기 전에는 미토콘드리아 바깥쪽 막에 느슨하게 결합하고 있다가 세포사멸 신호 (저산소)가 들어오면 막 안으로 들어간다 (위).... 20
그림 6. HGTD-P, BNip3 단백질을 E-coli에서 제작한 후 분리된 미토콘드리아와 혼합하여 시간의 경과에 따른 미토콘드리아 permeability transition을 관찰하였다.... 21
그림 7. Adrenomedullin을 처리한 후 저산소에 노출시켰을 때 세포내의 glutathione content (위)와 gamma-GCL의 활성도 (아래)를 측정한 결과 22
2차년도 연구내용 및 결과 22
Fig 1. Interaction of HGTD-P with Hsp90.... 23
Fig 2. Effects of Hsp90 inhibitors on cell death induced by HGTD-P overexpression.... 24
Fig 3. Regulation of HGD-P pro-apoptotic activity by Hsp90 is upstream of mitochondria.... 25
Fig 4. Effects of Hsp90 on mitochondrial translocation of HGTD-P.... 26
그림 5. V5가 붙어있는 HGTD-P를 세포내에 주입한 결과 AIF가 미토콘드리아에서 선택적으로 유리되는 현상을 발견하였으며 니는 세포 분획 후 면역블롯에서도 확인 되었다 (위).... 28
그림 6. Caspase-9 inhibitor를 처리한 후 HGTD-P를 세포내에 주입한 결과 미토콘드리아로부터 AIF가 유리되는 현상이 검소하였다.... 28
그림 7. 항산화제인 N-acetylcystein을 처리하면 HGTD-P에 의한 세포사멸과정에서 미토콘드리아로부터 AIF가 유리되는 현상이 감소하며 (왼쪽) 이와 함께 죽은 세포의 수도 감소 한다 (오른쪽). 28
3차년도 연구내용 및 결과 29
Figure 1. Hsp70 inhibits HGTD-P-induced cell death.... 29
Figure 2. Downregulation of hsp70 accelerates HGTD-P-induced cell 29
Figure 3. Hsp70 inhibits mitochondrial perturbation induced by HGTD-P overexpression.... 30
Figure 4. Hsp70 inhibits caspase activiation induced by HGTD-P.... 30
Figure 5. Bax inhibitor suppresses HGTD-P-induced cell death.... 31
Figure 6. DAD suppresses HGTD-P-induced cell death.... 31
Figure 7. DAD suppresses HGTD-P-induced cell death.... 32
Fig 1. Hypoxia up-regulates mHGTD-P expression in mouse neuronal cells.... 33
Fig 2. mHGTD-P overexpression induces neuronal cell death.... 34
Fig 3. mHGTD-P induces hypoxic neuronal cell death.... 35
Fig 4. mHGTD-P induces caspase-independent cell death in mouse neuronal cells.... 36
Fig 5. mHGTD-P induces mitochondrial release of AIF.... 36
Figure 1. HGTD-P expression is independent of amyloid beta toxicity.... 37
Figure 2. Suppression of HGTD-P expression is independent of amyloid beta toxicity.... 38
Figure 1. Hypoxia induces transcriptional downregulation of GLTSCR2 expression.... 39
Figure 2. GLTSCR2 sensitizes cells to hypoxic injury.... 39
Figure 3. GLTSCR2 induces cell death independent of hypoxia-responsive pro-death Bcl-2 family proteins.... 40
Figure 4. GLTSCR2 induces cell death independently of the mitochondrial death cascade.... 41
Figure 5. Cell death induced by overexpression of GLTSCR2 was not suppressed by co-overexpression of Bcl-2.... 42
Figure 6. Expression and subcellular localization of GLTSCR2.... 42
Figure 7. GLTSCR2 has two putative NLSs.... 43
Figure 8. GLTSCR2 induces cell death with apoptotic features.... 44
Figure 9. The cytotoxic domain of GLTSCR2.... 45
Figure 10. PTEN is crucial for cell death induced by GLTSCR2.... 46
Figure 11. The C-terminus of GLTSCR2is crucial for PTEN phosphorylation.... 47
Figure 12. GLTSCR2induces caspase-independent cell death without involvingmitochondrial apoptotic cascades.... 47
그림 1. Mouse neuronal cell에 vehicle, BNip3, BNip3ΔTM을 과발현 시킨 후 24시간 후에 10 um amyloid β를 처리한 후 다시 24시간 후에 cytotoxic assay를 시행하였다. 49
그림 2. siBNip3로 BNip3의 발현을 억제한 후 24, 48, 72시간 후에 amyloiud β에 대한 cytotoxicity를 측정한 결과 49
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