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SUMMARY(영문요약문)

CONTENTS

목차

제1장 연구개발과제의 개요 36

제1절 연구개발의 중요성 및 필요성 38

1. 기술적 측면 39

2. 경제·산업적 측면 39

3. 사회·문화적 측면 39

제2절 연구개발의 목표 및 내용 40

1. 최종목표 40

2. 평가방법 및 평가항목 40

3. 연차별 주요 사업 내용 및 범위 43

제2장 국내외 기술개발 현황 46

제1절 국내 기술개발 현황 48

제2절 국외 기술개발 현황 48

제3절 국내외 유사기술과의 차별성 49

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 52

제1절 환경 유해화학 물질에 대한 생물 분자 지표 발굴을 위한 기반 기술 구축(주관) 54

1. 상보적 DNA 마이크로어레이(cDNA microarray) 기반 기술 구축 54

2. 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이(Oligonucleotide microarray) 기반 기술 구축 57

3. 환경 유해화학물질별 표적 유전자들의 효용성 검증을 위한 실시간 정량 PCR(real time RT-PCR) 방법의 확립 및 적용 59

제2절 환경 유해화학 물질에 대한 표적 유전자의 발굴 및 검증(주관) 65

1. 내분비계 장애물질에 대한 cDNA microarray 기술을 이용한 표적 유전자 발굴 및 검증 65

2. 중금속류에 대한 cDNA microarray 기술을 이용한 표적 유전자 발굴 및 검증 80

3. Oligo microarray를 이용한 다환성 방향족 탄화수소류(PAHs) 특이적인 표적 유전자 (Characteristic Differentially Expressed(Expresssed) Genes; DEGs) 발굴 및 검증 90

4. Oligo microarray를 이용한 휘발성 유기 화합물(VOCs) 특이적인 표적 유전자 (Characteristic Differentially Expressed(Expresssed) Genes; DEGs) 발굴 및 검증 105

제3절 환경 유해화학물질에 대한 단백질 지표 발굴 및 검증(주관) 112

제4절 차세대 유전자 지표를 이용한 환경 독성 profiling 방법의 구축 및 활용(주관) 116

1. 환경 유해화학물질에 대한 unknown biomarker 발굴을 위한 Suppression Subtractive Hybridization (SSH) 방법 확립 및 생물지표 탐색 116

2. 환경 유해화학물질에 대한 unknown biomarker 발굴을 위한 GeneFishing 방법 확립 및 생물지표 탐색 126

3. 검증된 지표들을 집적한 Environmental monitoring (ENVI) Chip으로 활용을 위한 기반 구축 145

제5절 환경유해물질 2,3,7,8-TCDD 및 2,3,4,7,8-PCDF의 인간 간세포주(HepG2)분비 독성 단백체 지표 개발연구(1위탁) 151

제6절 환경 유해물질 2,3,7,8-tetrachloro dibenzo-p-dioxin (TCDD) 및 2,3,4,7,8-polychloro dibenzo furan(PCDF)의 쥐(Rat) 혈장 독성 단백체 지표 개발연구(1위탁) 163

제7절 세포분자생물학적 기법을 이용한 비교적 용이하고 신속한 DNA repair를 생물지표로 하는 분석기술 구축 연구(2위탁) 170

제8절 DNA repair 유전자의 전사적 활성을 분자적 지표로 하는 새로운 위해성 평가기법 개발(2위탁) 178

제9절 환경유해화학물질에 대한 산화적 스트레스의 분자지표 발굴을 위한 기반 기술 구축 연구 (3위탁) 185

제10절 각 범주별 환경 유해화학물질별 산화적 스트레스 지표 선정(3위탁) 199

제11절 다양한 범주의 유해화학물질에 산화적 스트레스 지표를 적용(3위탁) 220

제12절 환경 유해화학 물질군별 유전자 발현 프로파일 체계화 및 database 구축(주관) 235

1. DNA chip 지원 인프라 구축 235

2. 환경 유해 화학물질군별 유전자 발현 profile 정립 및 data 표준화 235

제4장 목표 달성도 및 관련분야에의 기여도 238

제1절 연구개발목표의 달성도 240

제2절 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가 242

제5장 연구개발결과의 활용계획 244

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 248

제7장 참고문헌 252

표 1. Components of Hybridization buffer 58

표 2. Primer sequences used in real time RT PCR 61

표 3. List of Down (A), reciprocal (B) and up (C) regulated genes by 10-8 M 17β-Estradiol, 10-6 M 4-Nonylphenol and 10-6 M Bisphenol A in MCF-7 cell lines.(비공개)(이미지참조) 72

표 4. 환경중 노출 농도 및 Mixture 형태에서 Alkylphenol 표적 유전자들의 발현 양상 비교(비공개) 79

표 5. Components of 혼성화(Hybridization) buffer 91

표 6. 다환성 방향족 탄화수소류(PAHs) 관련 표적유전자들의 실시간 정량 PCR(real time RT-PCR)을 위한 Primer 서열(비공개) 93

표 7. Up-regulated 공통 유전자(Common genes) expressed by 4 다환성 방향족 탄화수소류(PAHs) (벤조에이파이렌(benzo[a]yrene), 다이벤조에이에이취안트라센(dibenzo[a,h]anthracene), 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene, 나프탈렌(naphthalene)) in HepG2 세포(cells)(비공개) 101

표 8. Down -regulated 공통 유전자(Common genes) expressed by 4 다환성 방향족 탄화수소류(PAHs) (벤조에이파이렌(benzo[a]yrene), 다이벤조에이에이취안트라센(dibenzo[a,h]anthracene), 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene, 나프탈렌 (naphthalene)) in HepG2 세포(cells)(비공개) 102

표 9. Comparison of data obtained on 실시간(real time) RT-PCR and oligo 마이크로어레이 (microarray) experiments(M: 마이크로어레이(microarray), R: 실시간(real time) PCR)(비공개) 104

표 10. Formaldehyde 관련 표적 유전자들의 real time RT-PCR을 위한 Primer 서열 107

표 11. Comparison of data obtained on real time RT-PCR and oligo microarray experiments(비공개) 111

표 12. human 및 rat Selenoprotein W의 rabbit에서의 역가 수치 115

표 13. Primer sequences used in real time RT PCR 120

표 14. Up & Down-regulated genes screened by dot blot & sequencing. 124

표 15. Sequence-specific primers used for real-time PCR. 137

표 16. List of Differentially expressed genes by malachite green in HepG2 cells using Genefishing methods 141

표 17. Confirmation by quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) of mRNA expression patterns of four genes. 142

표 18. ENVI Chip에 집적된 유전자 list(비공개) 145

표 19. D. magna의 급성 독성 실험 결과 191

표 20. C. riparius의 급성 독성 실험 결과 192

표 21. C. tentans의 급성 독성 실험 결과 192

표 22. C. elegans의 수배지에서의 급성 독성 실험 결과 193

표 23. Cd, Pb, Cr, As에 노출된 인공 토양에서의 C. elegans 급성 독성 실험 결과 194

표 24. 스트레스 관련 유전자 증폭 primer 201

표 25. Cell cycles in Beas-2B cells measured 24 hrs after exposure to PCDDs/PCDFs from Korean waste incinerators 230

표 26. GC-MASS를 이용하여 매립지 토양시료 G, M, J의 DEHP 농도분석 232

그림 1. 실시간 정량 PCR 방법의 모식도 59

그림 2. Real time RT PCR에 의한 정량 원리 60

그림 3. -dF/dT vs. temperature plot displaying melting peaks of amplified PCR product. 63

그림 4. Melt curve graph of selenoprotein W (left) and selenoprotein P (right) 64

그림 5. KISTCHIP-400의 유전자 구성, 개발과정 및 validation 결과 65

그림 6. Effects of 17-estradiol, BPA and 4-NP on proliferation of MCF-7 cells 68

그림 7. Estrogen-responsive genes.... 76

그림 8. Quantitative determination of transcript levels by real-time PCR. 78

그림 9. 환경중 노출 농도의 Mixture 형태에서의 E-Screen Assay 결과 79

그림 10. human 8k cDNA microarray (Digital genomics Co.) 80

그림 11. Change of morphology of SH-SY5Y cells treated MeHg 83

그림 12. Result of MTT assay in SH-SY5Y cells treated to MeHg at 3, 6, 12, 24, 48, 72 hr,7 days. 83

그림 13. Identification of genes differentially expressed by MeHg on each time points.... 85

그림 14. Regulation of Selenoprotein W (SeW) by MeHg, (A) result of time course microarry by MeHg on SeW (B, C) Dose and time dependent down regulation of SeW by MeHg in SH-SY5Y cells (D) mRNA expression patterns of other selenoenzymes by MeHg in SH-SY5Y cells (E) relationship between SeW mRNA expression and... 86

그림 15. mRNA expression of early and late response genes in cells treated 1.4 uM MeHg examined in each time points. 87

그림 16. Effects of other heavy metal on mRNA level of selenoprotein W and intracellular glutathione level in the human neuroblastoma cells 88

그림 17. Comparison of Expression profile on Selenoenzymes in human neuroblastoma and astrocytoma cells 89

그림 18. Result of MTT assay in HepG2 cells treated to 벤조에이파이렌(benzo[a]yrene; B[a]P), 다이벤조에이에이취안트라센(dibenzo[a,h]anthracene; DB[a,h]A), 3-메틸콜란트렌(3-methylcholanthrene; 3MC), 나프탈렌(naphthalene; NP) for 48 hr. 95

그림 19. 4종의 다환성 방향족 탄화수소류(PAHs)에 의한 유전자 발현 양상 96

그림 20. 4종의 다환성 방향족 탄화수소류(PAHs) 류에 의해 공통적으로 고발현 (Up: 30유전자) 혹은 저발현 (Down: 106 유전자) 되는 유전자들 98

그림 21. 4종의 다환성 방향족 탄화수소류(PAHs) 에 대한 특이적인 표적유전자(DEG)의 functional clustering 98

그림 22. Effect of formaldehyde on HL-60 cells viability. 108

그림 23. HL-60 cell에서 Formaldehyde에 의한 유전자 발현 양상 (n=3) 109

그림 24. HL-60 cell에서 Formaldehyde에 의해 발현이 증가하고 감소하는 유전자들의 기능별 분류 110

그림 25. Results of Western blot on alkylphenol responsive proteins (Matrix Gla protein (MGP), H2A histone family/member X(H2AFX), breast_cancer_1 _early_onset (BRCA1)) in MCF-7 cells treated to 17b-estradiol (17b), bisphenol A (BPA), nonylphenol(NP) and octylphenol (OP) for 24h and 48h. 114

그림 26. Suppression Subtractive hybridization 방법의 개요 116

그림 27. Scheme of suppression subtractive hybridization method 117

그림 28. Primary and secondary PCR products of subtracted cDNA separated on a 2% TAE agarose gel.... 122

그림 29. (A) Plasmid prepared from white colony which candidates for DEG were coloned with T/A cloning vector; (B) Dot blot analysis of differential screened gene clones after SSH.... 123

그림 30. Confirmation of differentially expressed genes by MeHg using Real time RT-PCR 125

그림 31. ACP 구조. 128

그림 32. cDNA합성과 GeneFishing PCR protocol에 대한 flow chart 129

그림 33. Normal 및 canncer tissue를 GeneFishing 방법을 이용하여 DEG screening한 결과의 예시 129

그림 34. Effect of formaldehyde on Jurkat cells viability. 132

그림 35. Detection of formaldehyde -induced DNA strand breaks in Jurkat cells by the Comet assay. 133

그림 36. 포름알데히드에 대한 GeneFishing 결과... 134

그림 37. Effect of malachite green on HepG2 cells viability. 138

그림 38. Differentially expressed genes by malachite green in HepG2 cells using Genefishing methods 140

그림 39. The effect of malachite green on either early or late stage of HepG2 apoptosis as detected by flow cytometry. 144

그림 40. ENVI Chip의 Design 및 유전자 배열 모식도 149

그림 41. ENVI Chip의(Chip 의) real image 150

그림 42. ENVI chip의 spotting 검증을 위한 Syto61 test 결과 150

그림 43. MTT assay in HepG2 exposed to 2,3,7,8-TCDD and 2,3,4,7,8-PCDF 154

그림 44. LDH assay in HepG2 exposed to 2,3,7,8-TCDD and 2,3,4,7,8-PCDF 155

그림 45. DNA damage in HepG2 exposed to 2,3,7,8-TCDD and 2,3,4,7,8-PCDF 155

그림 46. 기존 2-DE (24x20cm) 시스템과 Long gel 시스템 (35x45cm)의 분해능 비교 결과 156

그림 47. Long gel 시스템 (35x45cm)에서의 분해능 증대로 인한 시료주입량 향상 결과 156

그림 48. 2-DE pattern of secreted proteins from HepG2 exposed to 2,3,7,8-TCDD and 2,3,4,7,8-PCDF 157

그림 49. 2-DE pattern and Image analysis of secterted proteins in HepG2 exposed to 2,3,7,8-TCDD 158

그림 50. 2-DE pattern and Image analysis of secterted proteins in HepG2 exposed to 2,3,4,7,8-PCDF 159

그림 51. 2-DE pattern and Image analysis of secterted proteins in HepG2 exposed to 2,3,7,8-TCDD and(뭉) 2,3,4,7,8-PCDF 160

그림 52. 2,3,7,8-TCDD 와 2,3,4,7,8-PCDF 단백체 지표들의 상호 연관성 161

그림 53. Band of western blot in HepG2 cell by 2,3,4,7,8-TCDD treatment 162

그림 54. Band of western blot in HepG2 cell by 2,3,4,7,8-PCDF treatment 162

그림 55. 2-DE pattern of plasma proteins of rats 165

그림 56. 2-DE pattern of plasma proteins of rats exposed to 2,3,7,8-TCDD and 2,3,4,7,8-PCDF 166

그림 57. 2-DE pattern and Image analysis of rat plasma proteins exposed to 2,3,7,8-TCDD 및 2,3,4,7,8-PCDF 167

그림 58. 2-DE(Fig 13. 2-DE) pattern and Image analysis of rat plasma proteins exposed to 2,3,7,8-TCDD 및 2,3,4,7,8-PCDF 168

그림 59. Nickel-induced cytotoxicity (MTT assay) 173

그림 60. No effect of cell cycle progression with lower dose Nickel-treated RKO cells 174

그림 61. Effect of MMS exposure time on AP site in MMS-treated cells 175

그림 62. MMS-induced DNA repair in RKO cells 176

그림 63. Low concentration of 20 uM Nickel exposure inhibits MMS-induced DNA repair 176

그림 64. DNA repair process interfere in Nickel-treatment cell using 6-4 pps ELISA assay 177

그림 65. Effect of Nickel treatment on the transcriptional activation of DNA repair gene Gadd45a in RKO cells 180

그림 66. Effect of Nickel treatment on the transcriptional activation of DNA repair gene APE in RKO cells 181

그림 67. Interaction of PCNA-Gadd45a interfered by Nickel 182

그림 68. 환경유해물질에 의한 분자독성을 제거하는데 필수적인 DNA repair protein system 중 PCNA 단백질과 Gadd45a 단백질 간의 결합 가능한 부위를 보여주는 3차 구조 이미지 183

그림 69. 환경유해물질에 의한 분자독성을 제거하는데 필수적인 dNA repair protein system의 모식도 183

그림 70. Gadd45a와 APE1의 상호작용에 따른 DNA repair 모델 제시 (Oncogene 2007) 184

그림 71. 동물 세포주 185

그림 72. 지표 생물종 185

그림 73. 인공토양에서의 C. elegans 급성 독성 실험 과정 187

그림 74. K-media에서의 C. elegans 급성 독성 실험 과정 187

그림 75. Chironomus의 급성 독성 실험 모습 188

그림 76. C. elegans의 생리학적 실험 결과 관찰 모습 189

그림 77. HepG2세포에서의 BPA, NP 급성 독성 실험 결과 190

그림 78. HeLa 세포에서의 CP, ES, PQ 급성 독성 실험 결과 190

그림 79. 다양한 오염물질노출로 인한 C. elegans의 성장 저해 실험 결과 (24시간 노출) 195

그림 80. 다양한 오염물질노출로 인한 C. elegans의 생식 저해 실험 결과 (24시간 노출) 196

그림 81. Cd, NP, BPA 에 96시간 동안 노출된 C. elegans의 발달 저해 실험 결과... 197

그림 82. PQ, ES, FT, CP에 96시간 동안 노출된 C. elegans의 발달 저해 실험 결과... 198

그림 83. Microarray과정 199

그림 84. DNA 손상 분석 실험 199

그림 85. GeneFishing™ DEG 200

그림 86. comet assay 201

그림 87. 중금속류에 노출된 C. elegans의 스트레스 관련 유전자 발현 실험 결과 (control=1, number=3; mean ± standard error of the mean; *p ＜ 0.05). 204

그림 88. 프탈레이트와 알킬페놀류에 노출된 C. elegans의 스트레스 관련 유전자 발현 실험 결과 (control=1, number=3; mean ± standard error of the mean; *p ＜ 0.05) 205

그림 89. 농약류에 노출된 C. elegans의 스트레스 관련 유전자 발현 실험 결과 (control=1, number=3; mean ± standard error of the mean; *p ＜ 0.05) 206

그림 90. C.tentans의 DNA 손상(NP, B[a]P, CP) and C.riparius의 DNA 손상(NP) 207

그림 91. D.magna의 DNA 손상 208

그림 92. 노닐페놀에 노출된 C. elegans를 이용한 DEG(differentially expressed genes)분석 (1, control ; 2, NP 0.1mg/L). 209

그림 93. Cd에 노출된 C. elegans를 이용한 DEG(differentially expressed genes)(DEGdifferentially expressed genes))분석 (1, control ; 2, Cd 8.5mg/L). 210

그림 94. 동물 세포주 HeLa 와 HepG2의 catalase 측정G. Benzo[a]pyrene (HepG2) 211

그림 95. C. elegans의 catalase 측정 212

그림 96. D. magna의(D. magna 의) catalase 측정 212

그림 97. 동물세포 HeLa의 GPx 측정 213

그림 98. 동물 세포주 HeLa의 SOD 측정 214

그림 99. 동물 세포주 HeLa와 HepG2의 지질과산화 측정 215

그림 100. Chironomus에서의 MDA측정 215

그림 101. C. ripirus에서의 지질과산화 측정 216

그림 102. C. elegans에서의 지질과산화 측정 216

그림 103. 유해화학물질 (NP, BPA, B[a]P)에 D. magna를 노출 시킨 후 헤모글로빈내 헤모글로빈 및 단백질 용량의 변화를 관찰 217

그림 104. 열충격 단백질과 녹색형광단백질을(녹색형관단백질을) 이용한 형질전환 C. elegans의 환경유해물질에 대한 반응 218

그림 105. 형질전환(형질전화) C. elegans (hsp-16.2::GFP and hsp-16.48::GFP)의 Cd 농도에 따른 형광 발광 측정 219

그림 106. Western blot 실험 과정 221

그림 107. 나노물질 SiO2 (7, 10 and 14 nm)와 CeO2 (15, 30 and 45 nm)를 처리한 Beas-2B 세포의 생존율 (n = 3, mean ± standard error of the mean) 224

그림 108. 나노물질 SiO2 (7, 10 and 14 nm)와 CeO2 (15, 30 and 45 nm) 처리한 세포의 세포사를 Flow cytometry를 이용하여 측정 224

그림 109. 나노물질 SiO2 (7, 10 and 14 nm)와 CeO2 (15, 30 and 45 nm)를 Beas-2B세포에 처리한 후 HO-1과 Cu/Zn SOD 단백질의 발현을 Western blot으로 측정... 225

그림 110. 나노물질 SiO2 (7, 10 and 14 nm)와 CeO2 (15, 30 and 45 nm)에 의한 ROS 생성을 DCFH-DA를 이용하여 관찰 225

그림 111. 나노물질 SiO2 (7, 10 and 14 nm)와 CeO2 (15, 30 and 45 nm)를 Beas-2B세포에 처리한 후 NFk-B, IkB and Nrf-2 단백질 발현을 Western blot으로 측정...(이미지참조) 226

그림 112. 나노물질 SiO2 (7, 10 and 14 nm)와 CeO2 (15, 30 and 45 nm)를 Beas-2B세포에 처리한 후 ERK, p38 and JNK단백질 발현을 Western blot으로 측정... 226

그림 113. PCDDs/PCDFs를 24시간 처리한 동물세포 Beas-2B에서 살펴본 AhR 유전자의 발현측정 (control=1, n=16, mean ± standard error of the mean) *p ＜ 0.05 227

그림 114. PCDDs/PCDFs를 24시간 처리한 동물세포 Beas-2B에서 살펴본 CYP 유전자의 발현측정 (control=1, n=16, mean ± standard error of the mean) *p ＜ 0.05 228

그림 115. PCDDs/PCDFs를 24시간 처리한 동물세포 Beas-2B에서 살펴본 TR과 HO-1 유전자의 발현측정 (control=1, n=16, mean ± standard error of the mean) *p ＜ 0.05 228

그림 116. PCDDs/PCDFs를 24시간 처리한 동물세포 Beas-2B에서 살펴본 CuSOD와 MnSOD 유전자의 발현측정 (control=1, n=16, mean ± standard error of the mean) *p ＜ 0.05 229

그림 117. PCDDs/PCDFs를 24시간 처리한 동물세포 Beas-2B에서 살펴본 p21과 p53 유전자의 발현측정 (control=1, n=16, mean ± standard error of the mean) *p ＜ 0.05 229

그림 118. PCDDs/PCDF시료를 24시간 처리한 Beas-2B세포의 세포사 관찰 231

그림 119. DEHP에 노출된 매립지 토양 G, M, J에 노출된 C. elegan를 이용한 급성, 성장, 생식 독성(A)과 스트레스 관련 유전자의 발현양 조사(B) 녹색형광 단백질과 열충격 단백질의 재조합을 통해 얻어진 형질전환 C. elegans종을 이용한 형광의 발현양 조사(C). 233