표제지

제출문

보고서 초록

요약문

SUMMARY

CONTENTS

목차

제1장 연구개발과제의 개요 11

제2장 국내외 기술개발 현황 15

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 19

가. 연구 범위 및 연구 수행 방법 19

제1세부과제 : Ub 변형효소 및 표적단백질 발굴과 이들의 작용 기전 19

제2세부과제 : Ubl 표적발굴 및 결합효소, 유리효소, 표적단백질의 작용기전 23

제3세부과제 : 유비퀴틴 의존성 단백질 분해의 작용기전 연구 32

나. 연구 수행 내용 및 결과 35

제1세부과제 : Ub 변형효소 및 표적단백질 발굴과 이들의 작용 기전 35

제2세부과제 : Ubl 표적발굴 및 결합효소, 유리효소, 표적단백질의 작용기전 54

제3세부과제 : 유비퀴틴 의존성 단백질 분해의 작용기전 연구 80

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 89

가. 연도별 연구개발 목표의 달성도 89

나. 관련 분야 기술 발전에의 기여도 93

(1) 연구개발의 최종목표 94

(2) 연차별 연구개발 목표 및 내용 95

(3) 계획대비 달성도 97

(4) 위 연구목표(총연구기간)에서 중요도 순으로 4-5개 목표 추출 및 가중치 부여 108

제5장 연구개발결과의 활용계획 109

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 110

제7장 참고문헌 112

연구개발 결과 활용계획서[개인신상정보 삭제]

자체평가의견서

Ub 변형효소 및 표적단백질 발굴과 이들의 작용기전

제출문

보고서 초록

요약문

SUMMARY

CONTENTS

목차

제1장 연구개발과제의 개요 153

가. 연구 개발의 목적 및 필요성 153

나. 연구 개발의 목표 및 범위 159

제2장 국내외 기술개발 현황 160

가. 학술적 측면 160

나. 기술적 측면 165

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 176

가. 연구 범위 및 연구 수행 방법 176

나. 연구 수행 내용 및 결과 180

별첨 : 연구 결과 그림 200

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 263

가. 연도별 연구개발 목표의 달성도 263

나. 관련 분야의 기술 발전에의 기여도 264

(1) 연구개발의 최종목표 266

(2) 연차별 연구개발 목표 및 내용 266

(3) 계획대비 달성도 267

(4) 위 연구목표(총연구기간)에서 중요도 순으로 4-5개 목표 추출 및 가중치 부여 270

제5장 연구개발결과의 활용계획 271

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 272

(1) BiFC (Biomolecular fluorescence complementation) 272

(2) MMP 272

제7장 참고문헌 274

연구개발 결과 활용계획서

자체평가의견서

Ubl 표적발굴 및 결합효소, 유리효소, 표적단백질의 작용기전

제출문

보고서 초록

요약문

SUMMARY

CONTENTS

목차

제1장 연구개발과제의 개요 311

제1절 연구개발의 필요성 311

제2절 연구개발의 최종 목표 및 연구 내용 312

제2장 국내외 기술개발 현황 314

제1절 국내외 타기관 연구개발 현황 314

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 318

제1절 연구범위 및 연구수행 방법 318

제2절 연구 결과 329

제3절 위탁과제 연구결과 349

제4절 표 및 그림 360

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 425

제5장 연구개발결과의 활용계획 439

1. 연구개발성과의 발표 439

2. 핵심 Ubl 연구기법의 사업단 후속 연구 및 국내 관련 분야 연구에의 활용 439

3. 바이로 산업의 자원개발 439

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 440

1. 표적단백질 및 관련 효소에 대한 주요 해외 연구 440

2. 유비퀴톰 관련 단백질들의 구조 기능에 관한 주요 해외 연구 441

제7장 참고문헌 443

연구개발 결과 활용계획서

자체평가의견서

유비퀴톰 의존성 단백질 분해의 작용기전 연구

제출문

보고서 초록

[요약문]

SUMMARY

CONTENTS

목차

제1장 연구개발과제의 개요 479

1. 연구 개발의 목적 479

2. 연구 개발의 필요성 479

1) 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (Ubiquitin-Proteasome System, UPS)의 기능 479

2) UPS의 기능 이상으로 인한 질병 발생 480

3) 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 작용 기구 및 조절 기전 480

4) 경제적, 사회적 측면의 필요성 481

3. 연구개발의 범위 482

제2장 국내외 기술개발 현황 483

1. 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 작용 기구 연구 483

2. Functional screening을 이용한 UPS 연구 484

3. 유비퀴틴 연결 단백질 연구 484

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 486

1. 연구범위 및 연구수행방법 486

1) 프로테아좀, E3 유비퀴틴 결합효소의 분리 및 동정 기술 개발 486

2) UPS 조절 유전자 동정을 위한 cell-based funtional screening 방법구축 489

3) 유비퀴톰 분석 기술 개발 (분리 및 동정 기술) 491

2. 연구내용 및 결과 493

1) 프로테아좀, E3 유비퀴틴 결합효소의 분리 및 동정 기술 개발 493

2) UPS 조절 유전자 동정을 위한 cell-based funtional screening 방법구축 501

3) 유비퀴톰 분석 기술 개발 (분리 및 동정 기술) 504

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 572

1. 평가착안점에 입각한 연구개발목표의 달성도 572

2. 연구개발 목표·내용 및 달성도 575

(1) 연구개발의 최종목표(1단계) 575

(2) 연차별 연구개발 목표 및 내용 575

(3) 계획대비 달성도 577

(4) 위 연구목표(총연구기간)에서 중요도 순으로 4-5개 목표 추출 및 가중치 부여 580

제5장 연구개발결과의 활용계획 581

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 582

제7장 참고문헌 583

연구개발 결과 활용계획서

자체평가의견서

Ub 변형효소 및 표적단백질 발굴과 이들의 작용기전 144

표 1. USP와 상호작용 하는 단백질들… 202

표 2. Chfr과 상호 작용하는 단백질 확인(2)… 237

Ubl 표적발굴 및 결합효소, 유리효소, 표적단백질의 작용기전 300

(표 1) 유비퀴톰관련 단백질들의 순수 정제의 결과 종합 360

(표 2) Yeast two-hybrid를 통해 screening한 SUMO 표적 후보단백질 361

유비퀴톰 의존성 단백질 분해의 작용기전 연구 469

(표 1) 질병과 Ub/proteaosme관계 480

유비퀴톰 의존성 단백질 분해의 작용기전 연구 469

표 1. UPS활성 조절 유전자들 547

표 2. 121 Proteins identified as ubiquitin substrates in mouse heart 567

표 3. Identification of proteins with ubiquitination sites 571

유비퀴톰 기능 연구 1

그림 1. 유비퀴톰의 연구범위.... 12

Ub 변형효소 및 표적단백질 발굴과 이들의 작용기전 144

그림 1. Ub-결합효소 (Es)에 의한 단백질의 유비퀴틴 결합 및 Deubiquitinaqting enzyme (DUB)에 의한 유비퀴틴 유리 과정 155

그림 2. NIH 유전자 정보은행 및 유럽 단백질체 정보은행 166

그림 3. 한국 유전자은행 및 미국 유전체 은행기구 166

그림 4. Ub 결합효소 family 및 SCF Ub E3 ligase 167

그림 5. SEAM-MudPIT 기술 요약도 168

그림 6. siRNA를 이용한 RaSPIT 기술의 요약도 169

그림 7. Ub/Ubl 유리효소 활성도 측정방법 순서도 170

그림 8. In vivo 상태에서 Ub/Ubl 활성도 측정방법 171

그림 9. Immuno-affinity를 이용한 Ub/Ubl 유리효소의 표적단백질 분리방법 173

그림 1. 6×His-GST-Ub-Ecotin을 이용한 UBP69의 활성도 측정 200

그림 2. 개체별 USP47 의 아미노산 구조.... 200

그림 3. SUSP2 유전자 발현 양상... 201

그림 4. mSUSP4의 조직 및 세포 내의 발현 양상... 201

그림 5. SUSP2의 intracellular localization... 202

그림 6. USP47과 katanin p60의 상호작용... 203

그림 7. USP47의 katanin p6O에 대한 deubiquitination 활성... 204

그림 8. USP47에 의한 katanin p60 단백질의 안정화 조절... 204

그림 9. USP47의 신경세포 (Neuro 2A)의 분화에 미치는 영향.... 205

그림 10. USP7과 HDAC1의 상호작용.... 206

그림 11. USP7에 의한 HDAC1의 deubiquitination.... 206

그림 12. USP7에 의한 HDAC1 단백질의 안정성 조절.... 207

그림 13. AR의 전사활성에 대한 USP7 영향... 208

그림 14. USP7-specific shRNA에 의한 HDAC1 단백질 안정성 및 AR 전사활성의 조절... 208

그림 15. Human SPOP과 Cullin 3의 상호결합... 209

그림 16. SPOP을 매개로 하는 Daxx와 Cul3의 상호 결합... 210

그림 17. Cul3, SPOP, Daxx co-localization... 211

그림 18. Daxx 단백질 분해에 대한 SPOP의 역할... 212

그림 19. SPOP shRNA에 의한 Daxx 분해의 억제... 213

그림 20. Daxx ubiquitination 에 대한 SPOP의 역할... 214

그림 21. SPOP에 의한 Daxx의 전사억제 기능 저해.... 215

그림 22. SPOP-mediated Daxx 분해와 세포사멸... 216

그림 23. SUSP4와 그의 p53 및 Mdm2와의 결합과 그들의 세포 내에서의 위치.... 217

그림 24. mSUSP4, p53 및 Mdm2 간의 상호 결합부위... 218

그림 25. SUSP4에 의한 p53과 Mdm2의 desumoylation.... 219

그림 26. Mdm2와 p53의 안정성이나 ubiquitination에 대한 SUSP4의 효과.... 220

그림 27. mSUSP4에 의한 p53 전사활성 조절... 221

그림 28. SUSP4의 세포 성장 억제 효과.... 222

그림 29. UV에 의한 SUSP4 발현의 유도.... 223

그림 30. RXRα의 UBC9 과의 상호 결합 및 in vitro 및 in vivo 에서의 sumoylation.... 223

그림 31. RXRα의 Sumoyation 위치 확인.... 224

그림 32. RXRα의 Sumoyation 에 따른 전사활성 조절.... 224

그림 33. RXRα의 homo-혹은 hetero-dimer의 전사활성에 대한 K108R 돌연변이체의 영향.... 225

그림 34. RXRα과 SUSP1의 상호결합 및 세포 내 co-localization.... 225

그림 35. SUSP1의 desumoyation 활성... 226

그림 36. SUSP1에 의한 RXRα의 전사활성 조절.... 226

그림 37. Ufm1 특이적 분해효소인 UfSP의 활성 분획... 227

그림 38. FLAG-Ufm1-VME를 이용한 UfSP의 표지... 227

그림 39. Mass spectrometry를 이용한 UfSP1의 동정... 228

그림 40. UfSP1과 UfSP2의 단백질 서열 분석 및 조직별 RNA 발현양상 분석... 228

그림 41. FLAG-Ufm1-VME를 이용한 UfSP1과 UfSP2의 표지.... 229

그림 42. UfSP1과 UfSP2의 Ufm1 특이적 단백질 분해효소 활성... 229

그림 43. UfSP1과 UfSP2의 기질 특이성... 230

그림 44. ISG15-특이적 표적 단백질의 발굴... 231

그림 45. Filamin-B가 ISG15의 표적단백질임을 확인... 232

그림 46. Filamin-B의 ISGylation을 통해 Filamin-B와 JNK module 간의 interaction이 저해.... 233

그림 47. Filamin-B의 ISGylation이 JNK cascade의 sequential activation에 미치는 영향.... 234

그림 48. Filamin-B의 ISGylation이 Filamin-B에 의해 유도되는 인터페론을 통한 세포사멸에 미치는 영향.... 235

그림 49. Chfr과 상호 작용하는 단백질 확인(1)... 236

그림 50. Chfr과 HDAC1의 상호작용 확인 (1)... 237

그림 51. Chfr과 HDAC1의 상호 작용 (2)... 238

그림 52. Chfr과 HDAC의 상호작용 확인 (in vitro)... 238

그림 53. SCFbeta-trcp에 대한 substrates 조사.... 239

그림 54. Chfr에 의한 HDAC1의 stability 변화 측정... 239

그림 55. Chfr에 의한 endogenous HDAC1의 stability 변화 측정.... 240

그림 56. Shchfr에 의한 HDAC1의 stability 증가... 240

그림 57. Chfr에 의한 HDAC1의 ubiquitination (in vitro)... 241

그림 58. Chfr에 의한 HDAC1의 ubiquitination (in vivo)... 241

그림 59. Chfr과 활성이 없는 HDAC1과의 상호 작용 확인... 242

그림 60. Chfr에 의한 활성이 없는 HDAC1의 stability 변화 측정.... 242

그림 61. Chfr에 의한 HDAC1의 활성 변화... 243

그림 62. Chfr에 의한 p21의 전사 수준 조절... 243

그림 63. Chfr에 의한 p21의 전사 수준 조절... 244

그림 64. Chfr에 의한 cell cycle 조절... 244

그림 65. Chfr과 HDAC1의 cell cycle 별 상호작용 확인... 245

그림 66. Chfr 에 의한 G1시기 촉진 확인... 246

그림 67. IR 처리 후 세포내 Chfr 에 의한 p21의 발현 촉진 확인... 247

그림 68. 정상세포와 암세포에서 Chfr 과 기질단백질의 발현 확인... 247

그림 69. 암세포에서 Chfr 에 의한 HDAC1 target 유전자의 발현 촉진... 248

Figure 70. HES cell에서 MMP의 표적 단백질로 발굴한 TSP-1 및 PTK7의 검증... 248

Figure 71. MMP-14을 처리하고 처리하지 않은 혈장 단백질의 2-D gel pattern과 MALDI-TOF mass를 이용한 ApoC-II와 TTR의 확인... 249

figure 72. MMP-3에 의한 plasma gelsolin의 절단 및 기능 분석... 250

Figure 73. MMP들에 의한 apoC-II 절단 및 절단 부위 분석... 251

Figure 74. MMP-14의 절단에 의한 apoC-II의 LPL cofactor 활성 손실.... 252

Figure 75. MMP-14에 의한 apoE의 절단 및 절단 부위 결정... 253

Figure 76. MMP-14에 의한 apoE 분해에 있어 lipid-bound form의 영향 및 smooth muscle cell (SMC) migration에 미치는 영향... 254

Figure 77. MMP-14에 의한 apoA-I의 절단 및 절단부위 분석... 255

Figure 78. VEGF에 의하여 유도된 human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)의 혈관신생, 이동, 침윤 영향 및 in vivo 혈관 신생에서의 sPTK7의 영향 분석... 256

Figure 79. VEGF에 의하여 유도된 HUVEC의 신호 전달 단백질들의 활성화에서 sPTK7의 영향 분석.... 257

Figure 80. MCF-7 세포에서 Snail 발현에 따른 TIMP의 발현 분석... 258

Figure 81. Deglycosylation에 의한 Snail TIMP-1 및 Neutrophil TIMP-1의 MMP 저해능 변화.... 259

figure 82. Snail TIMP-1의 MMP 저해 회피 기전 모식도 260

Figure 83. ELISA-based MMP-3/TIMP-1 binding assay 방법으로 Snail TIMP-1과 Neutrophil TIMP-1의 분석.... 261

Figure 84. 정상인과 악성 유방암 환자의 혈청 시료에 존재 하는 TIMP-1 양의 비교.... 262

Ubl 표적발굴 및 결합효소, 유리효소, 표적단백질의 작용기전 300

그림 1. NuMA의 sumoylation.... 362

그림 2. 그림 1. SENP1 NES의 기능.... 362

그림 3. SENP1에 의한 HIPK2 desumoylation.... 363

그림 4. IE1의 sumoylation에 미치는 PIAS1, PIAS3, PIASy 단백질들의 영향.... 364

그림 5. IE1 sumoylation에 PIAS의 영향 및 IE1-PIAS1 결합.... 364

그림 6. Cotransfection된 세포에서의 desumoylation assay.... 365

그림 7. E. coli sumoylation system.... 365

그림 8. E. coli에서 SUMO 변형된 PML의 제조 및 이를 이용한 in vitro desumoylation assay.... 365

그림 9. SENP1 의한 IE1 PML desumoylation.... 366

그림 10. (A) In vitro translated (IVT) PML과 E. coli에서 분리한 IE1의 in vitro sumoylation.... 366

그림 11. In vitro에서 IE1에 의한 PML desumoylation 여부의 분석.... 367

그림 12. (A) IE1과 SUMO 유리효소간의 결합을 보기 위한 GST pull-down 분석.... 367

그림 13. IE1과 SUMO 유리효소가 PODs 및 PML의 세포 내 분포에 미치는 영향 비교.... 368

그림 14. SUMO- independent PML aggregate의 형성에 미치는 IE1과 SENP1 의 영향 비교.... 369

그림 15. Types of ubiquitin E3 ligases.... 369

그림 16. The classes of BTB Protein families.... 370

그림 17. Expression test of KLHL8(69KDa).... 370

그림 18. Expression test of KLHL20(68KDa).... 371

그림 19. Expression test of ENC1- pVET1S and ENC1-pVET2S.... 371

그림 20. Expression test of ENC1- pVFT4.... 371

그림 21. Expression test of ENC1 - pVFT10S (smt fusion). 371

그림 22. The result of spop-pVFT1S and pVFT2S expression test.... 372

그림 23. The result of SPOP purification with ion- exchange method. 372

그림 24. The result of SPOP purification with ion-exchange method 372

그림 25. Mouse PIAS1 134-420 purification 결과.... 373

그림 26. CYLD TRAF2 region의 정제 profile. 373

그림 27. CYLD NEMO interaction region의 expression test. 374

그림 28. hUSP10의 N-terminal domain의 NTA purification profile. 374

그림 29. hUSP30의 catalytic core domain외 expression test. 374

그림 30. hBAP의 BRCA1 interaction region 의 NTA purification. 375

그림 31. A schematic model for the control of the p53-Mdm2 pathway by UlpB. 375

그림 32. hMDM2의 정제.... 375

그림 33. mUlpB의 정제. 376

그림 34. hMdm2와 mUlpB 1~212a.a와의 interaction관찰 되지 않음 376

그림 35. hMdm2와 mUlpB 1~320a.a와의 interaction이 관찰되지 않음. 376

그림 36. hMdm2 17~l25a.a와 mUlpB 1~320a.a은 interaction하지 않음 377

그림 37. The 1st chelating column-profile 377

그림 38. The 1st chelating column 378

그림 39. TEV protease treatment 378

그림 40. The 2nd. chelating column after TEV pretense treatment 378

그림 41. IE2를 이용한 EMSA 분석 379

그림 42. TEV protease treatment in several buffer condition 379

그림 43. TEV pretease treatment in several buffer condition 379

그림 44. Yeast에서 SENP1과 NuMA의 상호결합.... 380

그림 45. NuMA의 Sumoylation과 SENP1에 의한 desumoylation.... 380

그림 46. NuMA의 sumoylation site mapping.... 380

그림 47. NuMA sumoylation site의 mutation analysis.... 381

그림 48. NuMA의 sumoylation site 확인.... 381

그림 49. NFAT2 sumoylation외 확인 및 E3 결합효소 PIAS 단백질의 영향.... 382

그림 50. NFAT2 sumoylation 에 대한 PIAS3의 E3 효소 활성 확인 및 in vitro에서 NFAT2의 sumoylation 확인.... 382

그림 51. In vitro 에서 NFAT2의 sumoylation site mapping.... 383

그림 52. Cotransfection assay에서 NFAT2 sumoylation sites의 확인.... 383

그림 53. NFAT1과 NFAT2의 sumoylation sites의 비교.... 384

그림 54. Ionophore 처리에 의한 NFAT2의 핵 내 retention 에 있어서 sumoylation의 역할 분석.... 384

그림 55. NFAT2 sumoylation이 NEAT2에 의한 OSCAR promoter의 활성화에 미치는 영향.... 385

그림 56. SUMO 유리효소들의 구조 비교.... 385

그림 57. SUMO 변형된 표적단백질들의 생성 및 정제.... 386

그림 58. E.coli에서 His-SENP1의 생성 및 Ni-NTA column을 이용한 정제 386

그림 59. E.coli에서 wild-type 및 N 말단 truncation mutant His-SuPr-1의 생성 및 Ni-NTA column을 이용한 정제 387

그림 60. 정제된 SUMO 유리효소의 정량적 비교.... 387

그림 61. In vitro에서 SENPI 및 SuPr-1의 기질 특이성.... 387

그림 62. In vitro에서 SuPr-1 SUMO 유리효소 활성에 있어서 N-말단 deletion의 영향.... 388

그림 63. 배양세포에서 SuPr-1 SUMO 유리효소 활성에 있어서 N-terminal region deletion의 영향.... 388

그림 64. SENP2-SUMO-1 complex의 구조.... 388

그림 65. 배양세포에서 N-말단 deletion이 SuPr-1의 세포 내 분포에 미치는 영향.... 389

그림 66. 배양세포에서 N-말단 deletion이 PML에 대한 SuPr-1의 SUMO 유리효소 활성에 미치는 영향.... 389

그림 67. SENP1의 Nedd8 conjugation.... 390

그림 68. SENP1 Neddylation site mapping.... 390

그림 69. SENP1의 Neddylation site mutation analysis... 391

그림 70. SENP1의 Neddylation 이후 세포내 localization 변화.... 391

그림 71. SENP의 cytosol로 relocalization.... 392

그림 72. His-affinity purification 결과 분리된 단백질.... 392

그림 73. Thrombin cutting 결과.... 393

그림 74. mPIAS1 114~420, 124~420 His-affinity purification 결과.... 393

그림 75. mPIAS1 114~420, 124~420 thrombin cutting test.... 393

그림 76. mPIAS1 124~420 thrombin cutting, cation exchange purification 결과.... 394

그림 77. size exclusion chromatography 결과. 394

그림 78. Protein expression and solubility test of IE2 394

그림 79. The 1st(이미지참조) NTA affinity column result of IE2 395

그림 80. tetragonal 모양으로 자란 PIAS1(124-420)의 결정. 395

그림 81. needle 모양으로 자란 PIAS1(124-420)의 결정. 395

그림 82. Gate way cloning을 이용한 baculovirus발현 모식도 396

그림 83. baculovirus 를 이용한 유비퀴톰 단백질들의 발현 및 정제 397

그림 84. hUSP16N의 His-affinity purification test. 397

그림 85. Insect cell lysis with lysis buffer and hCYLD expression. 398

그림 86. USP3의 lysis조건 확립 398

그림 87. USP3의 ion-exchange 실험 398

그림 88. yeast two-hybridI 분석에서 IE1과 PIAS1의 결합.... 399

그림 89. Gel-filtration을 이용한 sumo와 Ubc9의 복합체 형성 여부 확인.... 399

그림 90. Gel-filtration을 이용한 PIAS1 (124-420)자 Ubc9의 복합체 형성 여부 확인.... 400

그림 91. 인산화 의존적 NuMA SUMO-modification.... 401

그림 92. 배양세포에서 인산화 의존적 NuMA Sumoylation.... 401

그림 93. NuMA wild-type의 세포주기에 따른 localization pattern.... 402

그림 94. NuMA sumoylation- deficient mutant의 localization 변화.... 402

그림 95. NFAT2의 sumoylation이 OSCAR promoter의 활성화에 미치는 영향.... 403

그림 96. NFAT2-Ubc9 fusion의 sumoylation.... 403

그림 97. NFAT2 발현 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조 바이러스의 배양. 404

그림 98. GATEWAY™ Cloning technology를 이용하여 구축 된 adenoviral vector의 확인 404

그림 99. Ubc9의 sumoylation 확인 및 sumoylation site mapping.... 405

그림 100. Pontin의 sumoylation.... 405

그림 101. SuPr-1의 sumoylation 확인.... 406

그림 102. E. coli sumoylation system을 이용한 SuPr-1의 sumoylation 확인.... 407

그림 103. SuPr-1의 SUMO consensus sequence의 확인 및 Lys 잔기의 분포 407

그림 104. SuPr-1의 sumoylation site mapping.... 408

그림 105. wt과 K74R mutant Supr-1의 SUMO 유리효소 활성 비교.... 408

그림 106. wt 과 K74R mutant Supr-1의 세포 내 분포 비교.... 409

그림 107. Nedd8에 의해 conjugation된 SENP-1의 localization 변화.... 409

그림 108. Nedd8 knock-down된 세포에서 SENP1 localization 변화.... 410

그림 109. SENP1-Nedd8 fusion protein의 localization 과 생화학적 특성.... 410

그림 110. SENP1-Nedd8 fusion protein의 세포내 생화학적 특성.... 411

그림 111. HIPK2와 WSB-1의 상호작용.... 411

그림 112. WSB-1과 결합하는 HIPK2의 domain mapping.... 412

그림 113. USP39의 정제.... 412

그림 114. 여러 가지 size의 SUPS4 construct의 발현 정도 test. 413

그림 115. SUSP4의 정제… 413

그림 116. USP3의 정제과정.... 414

그림 117. 순수 정제된 OTU1.... 414

그림 118. mouse PIAS 124-474의 정제.... 414

그림 119. Oxidation에 따른 p53 의 구조 변화.... 415

그림 120. Solution small angle light scattering실험을 통해 완성한 reptin oligomer의 ab initio model. 415

그림 121. EPR 이용한 helical lid의 이동 거리 측정.... 415

그림 122. HtrA 구조변화.... 416

그림 123. C1pP 구조.... 416

그림 124. Purified ISG15 conjugates.... 417

그림 125. Filamin의 ISG15 conjugation 확인... 417

그림 126. UBE1L의 ISG15 conjugation 확인.... 417

그림 127. VRS의 ISG15 conjugation 확인.... 417

그림 128. 6His-mISG15GG 단백질의 발현 확인... 418

그림 129. GST-UbcM8의 발현 확인... 418

그림 130. ISG15, UBE1L, UbcM8의 정제... 418

그림 131. SENP1의 ISGylation.... 419

그림 132. Pull-down 과 immunoblotting을 이용한 SENP1의 ISGylation 확인.... 419

그림 133. SENP1의 N-terminal 부분과 C-terminal 부분의 ISGylation.... 419

그림 134. Filamin B의 deletion mutant에 대한 모식도 및 ISGylation 여부 419

그림 135. Filamin B 22-24 부위의 Lys --＞ Arg mutant에 대한 ISGylation 여부 확인 420

그림 136. Filamin B Lys2467 --＞ Arg mutant에 대한 ISGylation 확인 420

그림 137. Ubp43-deficient cells 에서 IFN-β에 의한 apoptosis.... 421

그림 138. Ubp43-deficient mouse의 조직에서 poly(I-C)에 의한 apoptosis.... 421

그림 139. IFN-α/β signaling의 Jak/Stat pathway를 통해 apoptosis가 일어난다.... 422

그림 140. Ubp43-deficient골수세포에서 IFN-α/β-induced apoptosis는 P13K를 통해 일어나지 않는다.... 422

그림 141. Ubp43-deficient 골수세포에서 IFN-β에 의한 apoptosis는 CD95/Fas를 통해서 일어나지 않는다.... 422

그림 142. Mitochondrial membrane potential의 변화.... 423

그림 143. Ubp43이 결핍된 생쥐에서 IFN-β에 의한 apoptosis 과정 중 Bax의 활성화.... 423

그림 144. Ubp43이 결핍된 생쥐에서 IFN-β에 의한 apoptosis 과정 중 Caspase-3의 활성화를 확인.... 423

그림 145. pSRP-shUBP43의 활성 확인.... 424

그림 146. KT-1/shUBP43의 IEN-α에 대한 반응성 연구.... 424

유비퀴톰 의존성 단백질 분해의 작용기전 연구 469

(그림 1) Ub/proteasome의 다양한 기능 479

그림 3. 프로테아좀 정계와 정제된 단백질의 동정 506

그림 2. PAPase1이 프로테아좀과 직접적으로 결합증명 507

그림 3. PAPase1의 Phosphatase 활성 측정 508

그림 4. PAPase1 siRNA 처리 후 프로테아좀의 활성 측정 509

그림 5. PAPase1 siRNA 처리 후 PAPase1 sense mutant로 replacement 하여 프로테아좀의 활성 측정 510

그림 6. PAPase1 siRNA 처리 후 PAPase1 phosphatase mutant로 replacement하여 프로테아좀의 활성 측정 511

그림 7. TRIP12 와 proteasomal ATPases 간의 interaction 512

그림 8. TRIP12 와 proteasomal ATPases 간의 interaction 513

그림 9. TRIP12 siRNA 에 의한 Ub-GFP 기질의 분해 조절 514

그림 10. TRIP12 HECT domain 특이적 Ub-GFP 분해 515

그림 11. TRIP12 HECT domain 에 의한 Ub-GFP의 ubiquitination 516

그림 12. E4 의존적 Ub-GFP의 polyubiquitination 517

그림 13. TRIP12 HECT domain 의 autoubiquitination 활성 518

그림 14. TRIP12 HECT domain 의 ubiquitination 기전 519

그림 15. TRIP12 와 APP-BP1의 interaction 520

그림 16. Ubiouilin2 siRNA에 의한 CD3-δ의 안정성 증가 521

그림 17. HERP와 interaction 하는 단백질들의 분석 522

그림 18. HERP와 Ubiquilin들의 interaction 523

그림 19. TRIP12 와 β-adaptin의 interaction 524

그림 20. TRIP12의 과발현시 β-adaptin 의 분해 525

그림 21. TRIP12의 knockdown시 β-adaptin 의 안정성 526

그림 22. β-adaptin 의 ubiquitination 527

그림 23. TRIP12 knockdown cells에서 세포 내의 β-adaptin 발현 528

그림 24. TRIP12 와 APP-BP1 의 interaction 확인 529

그림 25. TRIP12 과발현에 의한 APP-BP1/Uba3 의 분해 촉진 530

그림 26. siRNA 를 이용하여 TRIP12 의 발현을 감소시켰을 때 APP-BP1/Uba3 의 분해 감소 531

그림 27. in vitro 에서 TRIP12 에 의한 APP-BP1 의 ubiquitination 532

그림 28. 인산화저해효소들에 의한 프로테아좀 기질의 변화 533

그림 29. CK2에 의한 Ub-GFP 발현영향 534

그림 30. CK2에 의한 프로테아좀 활성 변화 535

그림 31. CK2에 의한 19S 프로테아좀 인산화 536

그림 32. JNK에 의한 Ub-GFP 발현 영향 537

그림 33. JNK와 kinase3에 의한 프로테아좀 활성 변화 538

그림 34. PAPase1에 의한 RPN-A의 탈인산화 539

그림 35. PAPase1에 의한 프로테아좀 활성 변화 540

그림 36. sobitol에 의한 프로테아좀 활성변화 541

그림 37. 실험개요 542

그림 38. 펩타이드를 16O과 18O 물로 표지하는 방법(이미지참조) 543

그림 39. sobitol에 의한 인산화 펩타이드의 인산화 변화 544

그림 40. GFP-degron 스크리닝 모식도 545

그림 41. GFP-degron의 control 실험 546

그림 42. Caspase-12의 E2-UBA에 의한 안정화 548

그림 43. Proteasome활성저해 유전자에 대한screening result 549

그림 44. 유전자과발현의해 GFP-degron의 accumulation 550

그림 45. 유전자의 과발현에 의한 proteasome활성억제 551

그림 46. 유전자과발현에의한 ub-conjugates의 accumulation 552

그림 47. 유전자 siRNA에 의한 효과 553

그림 48. E2-25K 발현저해에 의한 ER stress 독성저해. 554

그림 49. PIG cascade에 의해 매개되는 ptoteasome활성억제 경로 555

그림 50. oxidative stress에 의한 세포사멸에 Atg 기여 556

그림 51. casuase12-FADD-AK2 complex 557

그림 52. CLN3 돌연변이 유전자에 의한 세포사멸에서 LiC1 효과 분석. 558

그림 53. A : 발현유전자 제조 B : DNA, RNA 및 단백질 발현 확인 C : 심장에서만 특이적으로 발현 확인 559

그림 54. 2번의 affinity 과정을 통하여 유비퀴틴-결합단백질을 enrichment함 560

그림 55. (그림 15) 단백질을 발현 정제(A)하고, 이를 이용하여 S5a interaction 단백질을 분리(B, C)함. 561

그림 56. HisF-Ub를 발현하는 생쥐의 생산 562

그림 57. Ubiquitinated proteins의 분리정제 563

그림 58. Enrichment of Ub-IP 564

그림 59. ubiquitin system 관련 단백질 565

그림 60. semi-quantitiative analysis 566