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목차

Contents 12

제1장 서론 19

가. 연구개발의 중요성 및 필요성 19

(1) 발병 사례 19

(2) 고감도 수중 미생물 다중 동시 측정 모니터링 용 나노바이오센서 개발의 필요성 21

(3) Protein chip을 이용한 바이오센서의 특징과 장점 21

(4) SPR immunosensor의 특징 및 진단 장치로써의 장점 23

(5) 폴리디아세틸렌 나노 프로브의 특징 및 센서기술로의 응용 장점 24

(6) 나노바이오칩 기술을 이용한 수중 미생물 다중 동시 측정 모니터링 시스템을 개발하게 된 동기 및 필요성 26

나. 연구개발의 국내외 현황 27

(1) 세계적 수준 27

(2) 국내수준 30

(3) 국내·외의 연구현황 33

제2장 연구개발의 목표 및 내용 35

가. 연구의 최종목표 35

나. 연도별 연구개발의 목표 및 평가방법 37

다. 연도별 추진체계 39

제3장 연구개발 결과 및 활용계획 42

가. 연구개발 결과 및 토의 42

(1) 병원성 미생물 탐지용 리셉터 (단클론 항체) 확보 42

(2) 단백질 칩 표면처리과정의 최적화 연구 46

(3) 경쟁적 면역 반응 적용 흐름식 표면 플라즈몬 공명 바이오센서를 이용한 실시간 병원성 미생물 검출 방법 49

(4) PDA liposome 기반 수중 미생물 탐지 센서 개발 53

(5) 금 나노입자 성장을 이용한 바이오 센서 개발 94

(6) 정량분석을 위한 하드웨어 개발 및 소프트웨어 작성 101

(7) 나노기술을 이용한 고민감도 환경오염 모니터링 시스템 제작 127

나. 연구개발 결과 요약 135

다. 연도별 연구개발목표의 달성도 139

라. 연도별 연구성과(논문·특허 등) 142

(1) 논문 142

(2) 특허 144

(3) 학술회의 145

마. 관련분야의 기술발전 기여도 149

바. 연구개발 결과의 활용계획 150

제4장 참고문헌 152

표 1-1. 수인성 병원균과 감염특징 20

표 3-1. CT value for inactivation of pathogenic microorganisms 42

표 3-2. Immunoglobulin 결합 능력 특성 비교 103

그림 1-1. (a) Immunofluorescence protein chip의 원리와 (b) 그것을 이용한 protein array chip. 22

그림 1-2. SPR 원리의 개략도 23

그림 1-3. PDA 나노프로브 면역센서 제작 및 작동 원리 25

그림 1-4. 크립토스포리디움의 oocysts를 fluorescent labeled antibody로 염색하여 검출하는 방법(AWPL, ARS, USDA). 28

그림 1-5. 환경이나 동물검체로부터 C. parvum를 탐지해 내기 위한 방법으로 polymerase chain reaction (PCR)... 28

그림 1-6. Monoclonal Ab를 이용하여 Cryptorporidium을 측정하기 위한 ELISA kit(TechLab, USA) 28

그림 1-7. 미국 Berkeley 대학에서 고안한 인플루엔자 바이러스 검출용 바이오센서 개략도 (리포좀 형태의 PDA 나노프로브에는 바이러스와 결합하는 sialic acid 기능기가 제시되어 있음). 29

그림 1-8. Mixed SAMs 기반 크립토스포리디움 실시간 검출용 SPR 분석용 바이오칩. 31

그림 1-9. SPR 바이오칩을 이용한 크립토스포리디움 실시간 검출 모식도. 31

그림 1-10. 유리 표면 상 PDA 나로프로브 고정화 사진 (한양대 연구팀). 32

그림 1-11. A. 본 연구실의 항체 고정화를 위해 개발된 PDA 프로브 (말레이미드 기능기를 이용하여 화학적으로 항체와 결합시킬 수 있음). B. PDA 프로브에서 제시된 기능기의 조성을 조절하면 프로... 32

그림 2-1. 연구 과제 핵심 기술 요약도 1 (SPR 면역 센서 시스템에서 크립토스포리디움의 신개념 면역 검출 모식도) 36

그림 2-2. 연구 과제 핵심 기술 요약도 2 (Application of the complex to amplify the SPR signal). 36

그림 2-3. 연구 과제 핵심 기술 요약도 3 (PDA 나노 프로브를 이용한 나노어래이 칩 기술) 37

그림 3-1. Life cycle of C. parvum. 43

그림 3-2. (a) Differential interference contrast (DIC) image of Cryptosporidium parvum oocysts, (b) Immunofluorescence image of C. parvum oocysts. Oocysts were stained with immunofluorescent antibodies. 44

그림 3-3. (a) Differential interference contrast (DIC) image of Giardia lamblia cysts, (b) Immunofluorescence image of G. lamblia cysts. Cysts were stained with immunofluorescent antibodies. 44

그림 3-4. Schematic representation of (EG)n-SAMs consisting of 1:3 ratio of HS(CH₂)11(OCH₂CH₂)6OCH₂COOH (EG6-COOH) to HS (CH₂)11(OCH₂CH₂)₃OH (EG₃-OH).(이미지참조) 47

그림 3-5. SPR signals for immobilization of streptavidin onto biotinylated mixed self-assembled monolayers (SAMs) followed by binding of the biotinylated anti-mouse IgM antibody. 48

그림 3-6. Binding of the primary antibody (monoclonal anti-C. parvum oocyst) on the secondary antibody (polyclonal anti-mouse IgM) arrayed Cryptosporidium chip according to its injection concentration. 49

그림 3-7. Schematic diagram of the fabrication procedure of the Cryptosporidium sensor chip. 50

그림 3-8. Biotinylated SAMs 위에 biotinylated 항체(910 RU) 결합으로 인한 streptavidin(1392 RU)의 고정화의 SPR 신호 50

그림 3-9. 경쟁적 면역반응 SPR 분석방법을 적용한 cryptosporidium 센서칩의 C. parvum oocyst의 검출범위(R²=0.9987, n=5) 51

그림 3-10. Cryptosporidium 센서칩의 수행검사 52

그림 3-11. Structure of 10,12-pentacosadiynoic acid(PCDA). 54

그림 3-12. Structure of PCDA-MI, a PCDA derivative with a maleimide headgroup. 54

그림 3-13. Schematic diagram of liposome prepared from mixture of PCDA and PCDA - MI. 54

그림 3-14. Maleimide activity (mM) of freshly prepared, non-polymerized liposomes prepared from mixture of PCDA and PCDA-maleimide of given PCDA-maleimide content... 55

그림 3-15. Time profile of maleimide activity for liposomes made with 10 (●), 20(▲) and 30 (■) mol% of PCDA-maleimide. Lines represent linear regression of each plots. 56

그림 3-16. Size of freshly prepared, non-polymerized liposomes prepared from PCDA and PCDA-MI in deionized water according to dynamic light scattering analysis. 56

그림 3-17. TEM images of unpolymerized (top row) and unpolymerized (bottom row) PDA liposomes prepared from different concentrations of PCDA-MI (0, 20, 40%). 57

그림 3-18. Antibody binding characteristics depending on PCDA-maleimide content upon liposome preparation (n=2). 58

그림 3-19. DSC traces of liposomes prepared with different mol% of PCDA-MI. Numbers to the right of the trace indicates content of PCDA-MI in mol%. 59

그림 3-20. Colorimetric response (CR, %) of bare, polymerized liposomes after 3 h incubation at 37 ℃ accoding to mol% of PCDA-MI. 59

그림 3-21. Color change of solution containing polymerized PDA-antibody (monoclonal anti-C, parvum) to buffer... 60

그림 3-22. Derivation of CR from A. PDA-antibody liposomes prepared from 10 (●), 20(▲) and 30 (■) mol% of PCDA-maleimide and their subsequent colorimetric response... 60

그림 3-23. Colorimetric property of polydiacetylenes. 61

그림 3-24. Chemical structures of diacetylene monomers and schematic drawing of a liposome 62

그림 3-25. Difference of morphology between Physical immobilization and chemical immobilization (8:2 molar ratio of PCDA and DMPC). 65

그림 3-26. Chemical structures of diacetylene monomers and schematic drawing of a liposome (8:2 molar ratio of PCDA and DMPC). 66

그림 3-27. Normal (light) image and fluorescent image of each molar ratio. 67

그림 3-28. Fluorescent intensities and each fluorescent image according to the ratio of PCDA and DMPC (9:1, 8:2, 7:3, 6:4 molar ratio) Fluorescence induced by UV (254 nm) exposure for 5 min and incubated at 80℃ for 10min. 68

그림 3-29. Chemical immobilization of PDA liposome on amine-coated glass by NHS/EDC treatment. The PDA liposome chip was incubated at 4℃ for 2 hr, Fluorescence induced by UV (254 nm) exposure for 5 min and incubated at 80℃ for... 69

그림 3-30. Reaction of carboxyl with amine by using NHS/EDC. 70

그림 3-31. Mimetic diagram of Ab Immobilization with Biotin & Streptavidin Interaction 70

그림 3-32. Fluorescentimages and intensity of the immobilized liposome according to the conjugation step of biotin, streptavidin, antibody and antigen subsequently UV (254 nm) exposure for 5 min. 71

그림 3-33. Antibody conjugation test with streptavidin-biotin chemistry. 72

그림 3-34. A. Mimetic diagram of Immune reaction with anti-IgM and IgM (anti-cryptosporidium). B. Fluorescence intensity. 72

그림 3-35. A. Mimetic diagram of Immune reaction with IgM (anti-cryptosporidium) and C. parvum oocyst. B. Fluorescence intensity. 73

그림 3-36. A. Mimetic diagram of wash-out problem during conjugation of anti-C. parvum (IgM, high molecular weight) oocyst. B. The fluorescent image of washed out liposome spots. 74

그림 3-37. To prevent the washout of immobilized liposome, exposure to UV (254nm) before antibody conjugation (1×107(이미지참조) oocyst/ml, 100ug/ml anti-IgM). 75

그림 3-38. Detection of C. parvum oocyst using the PDA liposome chip. The chip was incubated at room temperature (25℃) for 3 hr for immune reaction between the conjugation antibody on the PDA liposome spot and the oocysts... 76

그림 3-39. Detection of C. parvum oocyst using the PDA liposome chip. The chip was incubated at 37℃ for 3 hr for immune reaction between the conjugation antibody on the PDA liposome spot and the oocysts UV (254 nm) exposure for 5 min. 77

그림 3-40. Schematic representation illustrating the lack of a stable multilayer during immobilization of PDA liposomes onto solid substrates when a bio-receptor is conjugated (a), and proposed solution for... 78

그림 3-41. Chemical scheme for cross-linking PDA liposomes by interlinkers. First, acid-terminated PDA molecule, such as 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) are self-assembled into liposomes, then treated with n-hydroxy... 79

그림 3-42. The graph representing the fluorescence signals derived from solid-phase PDA liposomes "chips" depending on the added concentrations of interlinker during fabrication, PDA liposomes were immobilized onto a glass... 81

그림 3-43. The graph representing the fluorescence signals derived from solid-phase PDA liposomes "chips" depending on the added concentrations of interlinker during fabrication. Immobilized PDA spots were stimulated by heat (at... 82

그림 3-44. Immobilized PDA spots were conjugated with antibodies specific to Cryptosporidium parvum, washed and polymerized under UV light (254 nm) for 5 minutes. These PDA chips were exposed to C. parvum oocysts (107(이미지참조) units/mL) at... 83

그림 3-45. The graphs representing signal derived by sensor chip before antibodies were conjugated and when reacted with cognate antigen (Cryptosporidium parvum oocyst at 107(이미지참조) units/ml) at 37 ℃ for 30 min.... 85

그림 3-46. Graphs representing the fluorescence signals of quantitative analysis which was performed for 6 species of pathogens. Results for PDA chips conjugated with antibodies for (a) Cryptosporidium parvum... 87

그림 3-47. Graphs representing the specific response of PDA arrays to cognate antigen when immobilized with antibodies to 6 different pathogens. Specific response to (a) Cryptosporidium parvum oocyst, (b) Giardia... 88

그림 3-48. A representative image is showing multiplex detection of pathogens by PDA arrays. 90

그림 3-49. PDA liposome 기반 수중 미생물 실시간 동시 다중 검출 센서 칩으로 하천수 검출 92

그림 3-50. PDA liposome 기반 수중 미생물 실시간 동시 다중 검출 센서 칩으로 음용수 검출 93

그림 3-51. The whole scheme of the immunoassay 94

그림 3-52. UV-vis spectra of 12nm AnNps solution 95

그림 3-53. (a) Gold nanoparticles (AuNPs) are stabilized by carboxylic thiol derivatives. (b) To avoid this aggregation. 95

그림 3-54. Photographs showing color of AuNPs capped with different molar ratio of HS-OEG6(이미지참조)-COOH and HS-OEG₃-OH after reacted with EDC/NHS. 96

그림 3-55. Determination of minimal protein concentration 97

그림 3-56. Investigation of gold nanoparticles' growth behavior in presence of protein 98

그림 3-57. The behavior investigation of gold seeds growth kinetics. The gold seeds concentration was represented using the gold salt unit. 99

그림 3-58. The linear relationship between nanoseeds growth and concentration. 100

그림 3-59. G. lambila cysts 검출 101

그림 3-60. 세포벽에 Gold probe가 붙은 형상의 HRTEM 이미지 101

그림 3-61. 병원성 미생물에 대한 특이 단백질(항체)의 반응성 검토 102

그림 3-62. Protein G-IgG 결합 부위를 얻기 위한 PCR 반응 조건 및 PCR 산물 103

그림 3-63. Protein G-IgG 결합 부위 발현 벡터, pET14b-PGw 제작 모식도 104

그림 3-64. 염기서열 분석 결과 비교 104

그림 3-65. Cys-modified protein G (PGcys)의 SDS-PAGE 분석 105

그림 3-66. Cys-modified protein G (PGcys)의 immunoblotting 분석. 106

그림 3-67. Competitive solid-phase ELISA 방법을 이용한 항체 결합력 비교 106

그림 3-68. 형광 현미경 관찰. 107

그림 3-69. 표면 플라즈몬 공명장치를 이용한 protein G 박막 형성 분석 108

그림 3-70. AFM을 이용한 표면분석 108

그림 3-71. 고정화 단백질의 반응성 분석 109

그림 3-72. Zn이온을 이용한 항체 고정화 기술 모식도 109

그림 3-73. 표면 플라즈몬 공명장치를 이용한 protein G 박막 형성 분석 110

그림 3-74. AFM을 이용한 표면분석 110

그림 3-75. 항체 농도 변화에 따른 표면 플라즈몬 공명각의 변화 111

그림 3-76. Mixed 자기조립 박막 제작 모식도 111

그림 3-77. 몰비 변화에 따른 항체-항원 반응성 112

그림 3-78. 원자 힘 현미경을 이용한 딥-펜 나노리소그래피 기술 113

그림 3-79. soft lithography을 이용한 단일 클론 항체 패턴의 형광 분석 113

그림 3-80. 딥펜 리소그래피 기법을 이용한 단일 클론 항체 패턴의 AFM 이미지 114

그림 3-81. Sandwich ELISA의 분석 원리 115

그림 3-82. 센서 스트립 구성도 115

그림 3-83. 센서 스트립의 반응 개념도 116

그림 3-84. 발색 또는 발광신호의 발생 반응식 116

그림 3-85. 비특이적 결합을 최소화하기 위한 연구수행 결과(E. coli O157:H7에 대한 면역반응 실험) 117

그림 3-86. 면역 스트립을 이용한 E. coli O157:H7의 정성분석 결과 118

그림 3-87. 면역 스트립을 이용한 Salmonella typhimurium의 정성분석 결과 118

그림 3-88. 면역 스트립을 이용한 Legionella pneumophila의 정성분석 결과 119

그림 3-89. 면역 스트립을 이용한 Staphylococcus aureus의 정성분석 결과 119

그림 3-90. 면역 스트립을 이용한 Listeria monocytogenes의 정성분석 결과 120

그림 3-91. 교차반응성 검증 결과 120

그림 3-92. 면역스트립을 이용한 E. coli O157:H7의 정량분석 결과 121

그림 3-93. 면역스트립을 이용한 E. coli0157:H7의 정량곡선 121

그림 3-94. 면역스트립을 이용한 Salmonella typhimurium의 정량분석 결과 122

그림 3-95. 면역스트립을 이용한 Salmonella typhimurium의 정량곡선 123

그림 3-96. 면역스트립을 이용한 Salmonella typhimurium의 정량분석 결과 123

그림 3-97. 면역스트립을 이용한 Salmonella typhimurium의 정량곡선 124

그림 3-98. 면역스트립을 이용한 Staphylococcus aureus의 정량분석 결과 124

그림 3-99. 면역스트립을 이용한 Staphylococcus aureus의 정량곡선 125

그림 3-100. 면역스트립을 이용한 Listeria monocytogenes의 정량분석 결과 126

그림 3-101. 5종류 병원성 미생물의 다중 측정 정성분석 결과 126

그림 3-102. 항체의 방향성 제어에 따른 항원-항체의 반응성 127

그림 3-103. 계면활성제 사용에 따른 항원-항체의 반응성 128

그림 3-104. 고정화 항체의 공간적 제어에 따른 병원성미생물과 항체의 반응성 128

그림 3-105. 딥펜 리소그래피 기법을 이용한 단일 클론 항체 패턴의 AFM 이미지 129

그림 3-106. 고감도 환경 모니터링 센서 시스템 모식도 130

그림 3-107. 자성나노입자의 FE-SEM 사진과 표면의 화학적 작용기 131

그림 3-108. 효소가 증폭된 금나노입자 제작 모식도 131

그림 3-109. 항체양에 따른 금나노입자 응집 132

그림 3-110. 금나노입자에 표지된 HRP활성비교 : black circle : DIG-U이 삽입된 ssDNA와 HRP 표지된 anti-DIG이 결합된 금나노입자, control : DIG-U가 없는 ssDNA이 결합된 금나노입자 133

그림 3-111. 금나노입자에 표지된 HRP활성비교 : black circle : DIG-U이 삽입된 ssDNA와 HRP 표지된 anti-DIG이 결합된 금나노입자, red circle : DNA없이 HRP표지된 anti-DIG을 직접적으로 결합시킨 금나노입자 133

그림 3-112. E. coli O157:H7에 대한 제작된 센서의 응답 134